Essais d'agents pathogènes et de toxines

• Hépatite B

L'hépatite B est une infection du foie causée par le virus de l'hépatite B. Le VHB est transmis par l'exposition à des sources infectieuses. Le VHB est transmis par l'exposition à du sang ou à des liquides organiques infectieux (par exemple, salive, sperme, urine) ; les formes de transmission comprennent l'activité sexuelle non protégée, la transfusion sanguine, la transmission de la mère à l'enfant ou la consommation d'eau ou d'aliments contaminés. La maladie aiguë provoque une inflammation du foie, des vomissements et une jaunisse, tandis que l'infection chronique par le VHB entraîne souvent une cirrhose du foie et un cancer. Environ un tiers de la population mondiale a été infecté par le virus de l'hépatite B. De 5 à 10 % des adultes et 90 % des bébés qui ont été infectés seront porteurs du virus pour le reste de leur vie. L'infection peut être évitée par la vaccination. Le diagnostic de l'infection chronique par le virus de l'hépatite B (VHB) a longtemps été basé sur la sérologie VHB et la mesure des enzymes hépatocytaires. Avec le développement de thérapies pour l'infection chronique par le VHB, y compris l'interféron et la lamivudine, la détection quantitative du VHB (antigènes viraux et anticorps du patient) a été de plus en plus utilisée comme le marqueur le plus important pour surveiller l'activité de réplication du VHB, la progression de la maladie et l'évaluation du traitement antiviral. Plus précisément, l'antigène "e" de l'hépatite B (HBeAg) est un marqueur diagnostique important, généralement détectable chez les patients atteints d'une infection aiguë ; un test positif indique une forte réplication du VHB dans le foie, des titres élevés de VHB dans le sang et une plus grande infectiosité pour d'autres personnes. Plusieurs tests pour la mesure quantitative de l'ADN du VHB ont été développés, tels que les tests d'amplification de l'acide nucléique basés sur la PCR. Cependant, ces méthodes ont tendance à être lourdes et coûteuses. Le kit QuickTiter™ HBeAg ELISA de Cell Biolabs est un dosage immunoenzymatique développé pour la détection et la quantification de l'antigène "e" de l'hépatite B. Le kit a une limite de sensibilité de détection de ~10%. Le kit a une limite de sensibilité de détection de ~150 pg/mL HBeAg. Chaque kit contient suffisamment de réactifs pour réaliser jusqu'à 96 tests, y compris la courbe standard et les échantillons HBeAg. Principe du test Un anticorps monoclonal anti-HBeAg est adsorbé sur une plaque de microtitration. L'antigène de l'hépatite B "e" présent dans l'échantillon ou l'étalon se lie aux anticorps adsorbés sur la plaque ; un anticorps de souris anti-HBeAg conjugué au FITC est ajouté et se lie à l'antigène capturé par le premier anticorps. Après incubation et lavage, un anticorps de souris anti-FITC conjugué à la HRP est ajouté et se lie à l'anti-HBeAg conjugué à la FITC. L'anticorps anti-FITC de souris conjugué à la HRP non lié est éliminé lors d'une étape de lavage, et une solution de substrat réagissant à la HRP est ajoutée aux puits. Un produit coloré se forme proportionnellement à la quantité d'HBeAg présente dans l'échantillon. La réaction est interrompue par l'ajout d'acide et l'absorbance est mesurée à 450 nm. Une courbe standard est préparée à partir de l'HBeAg recombinant et la concentration de l'échantillon est alors déterminée.

• Expression virale

Le virus adéno-associé (AAV) appartient à la famille des Parvoviridae, un groupe de virus parmi les plus petits des virus à ADN monocaténaire et non enveloppé. Onze sérotypes différents d'AAV ont été signalés à ce jour. Le génome de l'AAV est constitué d'acide désoxyribonucléique simple brin (ADN ss), à sensibilité positive ou négative, d'une longueur d'environ 4,7 kilobases. Le génome est constitué de répétitions terminales inversées (ITR) aux deux extrémités du brin d'ADN ainsi que de deux cadres de lecture ouverts (ORF) : Cap (Capside) et Rep (Réplication). La région codante Cap contient des séquences nucléotidiques chevauchantes des protéines de capside VP1, VP2 et VP3, qui interagissent ensemble pour former une structure de capside icosaédrique. Introduction L'extrémité 5' du génome comporte deux promoteurs appelés p5 et p19, à partir desquels deux ARNm superposés de longueur différente peuvent être produits. Chacune des séquences d'ARNm contient un intron qui peut être épissé ou non, ce qui donne quatre ARNm différents et donc quatre protéines Rep possibles. Les noms des protéines décrivent leur taille en kilodaltons (kDa) : Rep78, Rep68, Rep52 et Rep40 (figure 1). Rep78 et Rep68 se lient à la structure en épingle à cheveux de l'ITR et clivent le site de résolution terminal dans l'épingle à cheveux. Il a également été démontré que ces deux protéines sont nécessaires à l'intégration du génome de l'AAV. Il a été démontré que les quatre protéines Rep ont une activité hélicase et peuvent lier l'ATP. Il a également été démontré que ces protéines augmentent la transcription à partir du promoteur p40 et diminuent la transcription à partir des promoteurs p5 et p19.