Die Öl-Rot-O-Färbung basiert auf der Verwendung eines Lysochroms (fettlöslicher Farbstoff) und eines Azofarbstoffs, der für die Visualisierung von neutralen Triglyceriden und Lipidon-Gewebeschnitten verwendet wird.

Ölrot O gehört zu den Sudan-Farbstoffen wie Sudan III, Sudan IV und Sudan Black B. Ölrot O hat jedoch nach und nach die Sudan-III- und Sudan-IV-Farbstoffe ersetzt, da die von Ölrot O erzeugte Rotfärbung viel intensiver ist, was die Visualisierung erleichtert.

Die Öl-Rot-O-Färbung wird an frischen oder gefrorenen Proben durchgeführt. Die in Paraffin eingeschlossenen Gewebe sind mit dieser Färbung nicht kompatibel, da bei der Vorbereitung der Schnitte und insbesondere bei der Verwendung von Lösungsmitteln Lipide entfernt werden.

Die Öl-Rot-O-Färbung basiert auf der Verwendung von 4 Reagenzien für die Färbung von Fettzellen nach der Methode von Johnson.