Bei den herkömmlichen 2D-Zellkulturmethoden sind die Zellen einem unphysiologischen architektonischen Zustand ausgesetzt. Wenn sie in 2D kultiviert werden, nehmen Säugetierzellen einen bipolaren Zustand mit einer basalen und einer apikalen Seite an. Um diese unnatürliche Morphologie zu erreichen, wird das Zytoskelett neu modelliert und die anschließende Ultrastruktur der Zelle stark verändert (Ravi et al., 2015). In 2D kultivierte Zellen haben außerdem unbegrenzten Zugang zu Sauerstoff, Nährstoffen und Metaboliten, was in den entsprechenden Geweben in vivo nicht der Fall ist. Diese Einschränkungen bedeuten letztlich, dass Labors, die in dieser unnatürlichen Umgebung Tests an Zellen durchführen, weniger zuverlässige Ergebnisse in vitro erzielen.

Die 3D-Zellkultur schafft eine 3D-Architektur für das Zellwachstum und bietet eine engmaschige und physiologisch relevante Umgebung. Das Wachstum von Zellen auf 3D-Scaffolds fördert genaue Interaktionen zwischen den Zellen und zwischen den Zellen und der extrazellulären Umgebung mit variablem Zugang zu Sauerstoff, Nährstoffen und Metaboliten. Säugetierzellen, die sich in einer repräsentativeren Umgebung befinden, die ihr Wirtsgewebe in vivo widerspiegelt, weisen in vitro eine relevantere Genexpression, Spleißtopologie und Biomarker auf, was wiederum eine weitaus größere Zuverlässigkeit bei der Modellierung von Medikamenten und Toxizität im Labor bietet (Lv et al., 2016).

Gerüstkonstruktion

Jüngste Studien belegen die Bedeutung diskreter Sauerstoffgradienten für die Zellbewegung an der Gerüstoberfläche (Ardakani et al., 2014). Zellen, die auf Woodpile-Strukturen gezüchtet werden, weisen typischerweise eine heterogene Verteilung auf, wobei es häufig zu Clustern kommt. Durch die Einführung eines diskreten Sauerstoffgradienten an der Grenzfläche unseres 3D-PETG-Gerüsts fördern wir die Zellproliferation vom Zentrum zur Peripherie. Das Ergebnis ist ein viel ausgewogeneres System von Zellen auf dem Gerüst, mit Konfluenzmustern, die denen von In-vivo-Gewebe ähneln.

Copner Biotech hat eine maßgeschneiderte 3D-Modellierungssoftware und eine 3D-Drucktechnik der nächsten Generation entwickelt, um diese komplexen Architekturen zu erstellen. Unser additiver Herstellungsprozess zeichnet sich durch eine hohe Konsistenz von Charge zu Charge aus und minimiert die Variablen in Ihren 3D-Zellmodellen.

 

Validierung der Mikrostruktur des Gerüsts - (links) Draufsicht auf das PETG-Gerüst unter einem Standard-Lichtmikroskop. (Rechts) Querschnitt eines PETG-Gerüsts, aufgenommen mit dem Rasterelektronenmikroskop (SEM).

Protokolle für Sterilisation und Zellaussaat

Hinweise vor dem Start

• Vor der Verwendung müssen die Gerüste 15 Minuten lang mit 70 %igem Ethanol gewaschen werden, um sie hydrophil zu machen. Bitte beachten Sie, dass die Scaffolds vor der Verwendung in der richtigen Ausrichtung platziert werden müssen (siehe Abbildung unten). Beim Waschen mit Ethanol ist darauf zu achten, dass die Lösung gründlich durch die miteinander verbundenen Poren des Gerüsts pipettiert wird.
• Fügen Sie genug Ethanol hinzu, um das Gerüst vollständig zu bedecken, entfernen Sie es und waschen Sie es 2x mit einem geeigneten Kulturmedium (2 ml).
• Um ein Austrocknen zu vermeiden, lassen Sie das Gerüst im letzten Waschmedium (2 ml), bis es benötigt wird.
• Wir empfehlen, das Gerüst 4 Stunden lang in diesem Endmedium zu belassen, um die nachfolgende Zellanlagerung zu verbessern.

Richtige Gerüstausrichtung - Das Gerüst ganz links stellt die richtige Ausrichtung für die Verwendung dar, während die anderen Gerüste auf dem Kopf stehen. Bitte beachten Sie, dass die Basis der Gerüste unterschiedlich aussehen kann.

Aussaat von Zellen auf Gerüst

• Entfernen Sie vor der Aussaat mit einer Pipette das gesamte Zellkulturmedium aus der Vertiefung.
• Pipettieren Sie langsam die von Ihnen gewünschte Zelldichte mit Hilfe von 100 ul Zellkulturmedium auf die Oberseite des Gerüsts und achten Sie dabei darauf, dass die Lösung die miteinander verbundenen Poren so weit wie möglich durchdringt.
• Stellen Sie die besiedelten Gerüste für 3 Stunden in den Inkubator, damit sich die Zellen anlagern können.
• Nach der 3-stündigen Inkubation füllen Sie die verbleibenden Vertiefungen mit 1,4 ml des vollständigen Mediums.
• Wechseln Sie das Nährmedium alle 2 Tage bis zum Ende der Kultur.
• Die Zellen können nach einer 15-minütigen 1fachen Trypsinbehandlung aus dem Gerüst gewonnen werden.
• Wir empfehlen, zunächst mehrere Zelldichten zu verwenden, um das Kulturprotokoll vor Ihren Experimenten zu optimieren.
• Die empfohlene Zelldichte liegt zwischen 150.000 und 500.000 Zellen pro Scaffold.

Zelluläre Anhaftung

Copner Biotechs 3D-PETG-Scaffolds vermitteln effizient die Anheftung von Säugetierzellen, während gleichzeitig niedrige Zellaussaatkonzentrationen verwendet werden. Zu den bisher verwendeten Zellen gehören unter anderem L929-Fibroblasten, Keratinozyten, HeLa-Zellen, MCF-7-Zellen, A549-Zellen und iPSCs.

Rasterelektronenmikroskopische (REM) Aufnahmen von L929-Zellen, die an Tag 7 auf einem PETG-Gerüst gewachsen sind (50 000 Zellen wurden an Tag 1 ausgesät). Die Zellen zeigen eine erfolgreiche Migration vom Zentrum zur Peripherie des Gerüsts, wobei ein ausgewogenes, konfluentes Zellsystem entsteht.

Unser maßgeschneidertes 3D-Druck-Betriebssystem, gekoppelt mit hochpräziser Drucktechnologie, ermöglicht die Schaffung spezifischer Gerüstbereiche mit optimaler Oberflächenrauheit. In diesen Regionen entstehen die ersten erfolgreich angehefteten Zellen ab Tag 1 der Aussaat und bilden den Ausgangspunkt für die Zellproliferation und Migration in die Peripherie. Die Migration wird durch diskrete Sauerstoff- und Nährstoffgradienten an der Gerüstoberfläche stimuliert, die durch die Heterogenität der Porengröße und -verteilung entstehen.

Zelluläre Lebensfähigkeit

Unser PETG-Material wurde verändert, um die Oberflächenrauhigkeit zu optimieren und damit die Zellanhaftung und -vermehrung zu verbessern. Dieses inerte, nicht zytotoxische Material ist nachweislich sicher für die Verwendung in der Zellkultur und hat keine negativen Auswirkungen auf das Zellwachstum oder die Zellfunktion, was Ihnen den Übergang von der 2D- zur 3D-Zellkultur erleichtert.

3D-PETG-Gerüste sind außerdem steif und zersetzen sich nicht, was sie sehr benutzerfreundlich für die Langzeitkultur von Zellen macht.

Zytotoxizität (A) LDH-Freisetzung (n=3), gemessen anhand der optischen Dichte bei 490 nm (B) Relative Fluoreszenzintensität des AlamarBlue-Tests (n=3). Die L929-Zelllinie wurde in einer Dichte von 1 x 104 Zellen mit Kontrollmedien, konditionierten Medien von Tag 1 oder konditionierten Medien von Tag 7 für 24 Stunden bei 37°C kultiviert. Abbildung 13 zeigt (A) LDH-Freisetzung (n=3) für jede Behandlungsbedingung, ermittelt durch die optische Dichte bei 490 nm (B) Relative Fluoreszenzintensität des almarBlue-Tests (n=3) für jede Behandlungsbedingung. Statistische Signifikanz bestimmt durch Friedmans-Test; * p < 0,05.

Zelluläre Proliferation

Unser PETG-Material vermittelt die Zellteilungsvorgänge und minimiert gleichzeitig den Zellverlust, was zu einer erheblichen Vergrößerung der Kulturen in kurzer Zeit führt. Dies ist besonders nützlich für diejenigen, die Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase studieren oder Zellteilungsvorgänge in Echtzeit untersuchen wollen.

Die unten aufgeführten L929-Zellen zeigten im Vergleich zur Standard-2D-Kultur eine deutlich gesteigerte Fähigkeit zur Bildung länglicher fokaler Adhäsionspunkte auf 3D-PETG-Gerüsten. Die fokale Adhäsion an den verschiedenen Oberflächen des Gerüsts ist wichtig für die Auslösung verschiedener Signale, die die Zellproliferation und -differenzierung weiter anregen (Lee et al., 2004).

(Links) Relative Fluoreszenzintensität des AlamarBlue-Tests (n=3) zu den Zeitpunkten Tag 1 und Tag
7. Statistische Signifikanz bestimmt durch gepaarten t-Test; * p < 0,05, ** p < 0,01. (Rechts) Verlängerte fokale Adhäsionspunkte, die auf eine gesunde Fibroblastenmorphologie in der 3D-Kultur hinweisen.

Sphäroid-Bildung

Bei der Verwendung hoher Zellaussaatkonzentrationen und der Kultivierung über einen längeren Zeitraum (7 Tage+) fördern 3D-PETG-Gerüste die Bildung von Sphäroid-Kulturen. Sphäroid-Kultursysteme bieten ein ähnliches physikalisch-chemisches Umfeld wie in vivo, indem sie Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen erleichtern und so die Einschränkungen herkömmlicher 2D-Kulturen überwinden.

Das 3D-PETG-Gerüstsystem verfügt über miteinander verbundene Poren in der gesamten Struktur und ist für die Kultivierung und Ernte von Sphäroid-Kulturen mit einfacher Handhabung konzipiert. Durch die Nutzung des Mittellochs des Gerüsts können die Benutzer Sphäroidkulturen durch Auf- und Abpipettieren mit minimaler Kraftanstrengung ansaugen und ernten. Diese neuartige Methode der Sphäroidkultur und -ernte ermöglicht es den Anwendern, zuverlässige 3D-Sphäroidmodelle zu erstellen, ohne dass mehrere Schritte erforderlich sind und menschliche Fehler bei der Handhabung der Sphäroide auftreten.

 

REM-Bilder von dermalen Sphäroiden, die auf 3D-PETG-Scaffold kultiviert wurden. Fibroblasten und Keratinozyten wurden 7 Tage lang kultiviert, nachdem sie am ersten Tag mit einer Konzentration von 100K ausgesät worden waren. Die Sphäroide ließen sich durch Absaugen mit einer Pipette leicht aus den Gerüsten entnehmen und wiesen im Vergleich zu den Methoden der Entnahme aus Hydrogelsystemen weniger Schäden auf.

Bildung von Organoiden

Neben der Sphäroidbildung können die 3D-Scaffolds in Verbindung mit den entsprechenden Wachstumsfaktoren auch zur Erzeugung früher Embryoidkörper und späterer Organoide verwendet werden. Scaffolds können aufgrund ihrer robusten Struktur und Festigkeit für die Langzeitkultur von Organoiden verwendet werden.

Abbildung - Frühe embryoide Körperstrukturen (Bild oben links) können aus der Gerüststruktur herauspipettiert und zu größeren, komplexen organoiden Strukturen (Bild oben rechts) in Platten mit geringer Befestigung weiter kultiviert werden. Die zellulären Strukturen können während und nach der Kultur gefärbt und mikroskopisch sichtbar gemacht werden (Bild unten rechts).

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