Aus mesenchymalen Stromazellen gewonnene extrazelluläre Vesikel zur Umkehrung der Leberfibrose in 3D-Leber-Sphäroiden

Die Pathogenese der Leberfibrose ist komplex und beinhaltet die Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen, die Rekrutierung von Lebermakrophagen und die Aktivierung von Leberstellatzellen (HSZ) [1]. HSZ sind für die Entwicklung der Leberfibrose von entscheidender Bedeutung, da sie eine phänotypische Veränderung von inaktiven, Vitamin A speichernden Zellen zu Myofibroblasten durchlaufen, die in der Lage sind, zu proliferieren und ECM-Komponenten zu produzieren [2]. Aktivierte HSZ zeichnen sich durch die Expression von Alpha-Glattmuskel-Aktin (α-SMA) und die Synthese von ECM-Proteinen, einschließlich Kollagen Alpha 1 Typ I (COL1A1), aus, die sich in der Leber ansammeln und das Fortschreiten der Fibrose fördern [3,4].

Unter den verschiedenen chronischen Lebererkrankungen stellt die Leberfibrose aufgrund ihrer hohen Prävalenz und ihrer erheblichen Auswirkungen auf die Krankheitsprognose und die Lebensqualität ein wichtiges globales Gesundheitsproblem dar [5,6]. Das Fortschreiten der Leberfibrose kann zu einer Zirrhose führen, die weltweit jährlich etwa 1 Million Todesfälle verursacht [7]. Darüber hinaus haben etwa 80-90 % der Patienten mit hepatozellulärem Karzinom eine Vorgeschichte mit Leberfibrose [8,9]. Eine frühzeitige Diagnose und Behandlung der Leberfibrose sind entscheidende Schritte, um die globale Gesundheitsbelastung zu verringern. Obwohl in den letzten Jahren zahlreiche antifibrotische Medikamente in vivo getestet wurden, ist keines davon für den klinischen Einsatz zugelassen worden [10]. Vielversprechende neue Ansätze wie die stammzellbasierte regenerative Medizin und die Nanotherapie haben sich jedoch als potenzielle Behandlungsmethoden für Fibrose erwiesen [11].

Mesenchymale Stromazellen (MSCs) sind fibroblastenähnliche Zellen, die sich osteogen, chondrogen und adipogen differenzieren können [12]. Darüber hinaus weisen MSC immunsuppressive, entzündungshemmende und antifibrotische Eigenschaften auf [13]. In den letzten Jahrzehnten wurden MSZ in verschiedenen Organen entdeckt, darunter im Knochenmark (BM-MSZ) und in der Nabelschnur (UC-MSZ), und ihre positive Wirkung wurde bei Lungenschäden, Herzinfarkt, Diabetes und Leberzirrhose nachgewiesen [14]. Trotz der zahlreichen Vorteile von MSZ kann ihre Verabreichung mit einigen Nachteilen verbunden sein. So können beispielsweise die genetische Instabilität in vitro und das Risiko der Tumorentstehung ihre klinische Anwendung bei Patienten einschränken [15].

MSC üben ihre therapeutische Wirkung hauptsächlich über einen parakrinen Mechanismus aus, indem sie verschiedene Zytokine, Wachstumsfaktoren und extrazelluläre Vesikel (EVs) freisetzen [13]. Der Begriff EV umfasst eine vielfältige Gruppe von membrangebundenen Nanopartikeln, darunter apoptotische Körper (1-5 µm groß), Mikrovesikel oder Ektosomen (100-1000 nm) und Exosomen (50-150 nm). Durch die Übertragung von Proteinen, Lipiden und verschiedenen RNA-Spezies auf Empfängerzellen können EVs epigenetische Veränderungen in geschädigten Gewebezellen hervorrufen und so deren Regeneration fördern [16]. 

In den letzten Jahrzehnten haben aus MSZ gewonnene EVs (MSC-EVs) ein enormes therapeutisches Potenzial bei verschiedenen chronischen Krankheiten gezeigt, insbesondere bei der Bekämpfung von Leberfibrose, vor allem durch die Verringerung von Entzündungen und Kollagenablagerungen [17,18]. Kürzlich haben wir gezeigt, dass EVs, die aus menschlichen Leberstammzellen (HLSCs) isoliert wurden, bei denen es sich um leberresidente MSC-ähnliche Zellen handelt, die Expression spezifischer Fibrosemarker verringern und die lncRNA-Landschaft in der Leber von Mäusen mit nichtalkoholischer Steatohepatitis (NASH) beeinflussen können [19,20]. Darüber hinaus haben wir in einem In-vitro-Modell der Leberfibrose auf der Grundlage von durch den transformierenden Wachstumsfaktor beta 1 (TGF-β1) aktivierten HSCs, die in einer Monolage kultiviert wurden, gezeigt, dass EVs aus HLSCs und BM-MSCs die Expression von αSMA und COL1A1 in aktivierten HSCs wirksam herunterregulieren können [21]. Die beobachtete antifibrotische Aktivität könnte auf die verschiedenen Komponenten zurückzuführen sein, die von den MSC-EVs transportiert werden, insbesondere auf das Vorhandensein spezifischer miRNAs, wie miR-146a-5p [21], miR-378c [22] und miR-199a-5p [23,24].

Ein wesentlicher Nachteil der herkömmlichen zweidimensionalen (2D) Zellkultur ist das Fehlen der umgebenden Mikroumgebung und der Interaktionen zwischen den verschiedenen Arten von Leberzellen, was eine genaue Reproduktion der pathophysiologischen Mechanismen der Leberfibrose erschwert [25]. Die jüngste Entwicklung dreidimensionaler (3D) Kultursysteme hat es jedoch ermöglicht, die komplizierten Interaktionen zwischen den verschiedenen Zellen, die am Fortschreiten der Fibrose beteiligt sind, sowie die architektonischen und funktionellen Veränderungen zu untersuchen, die für die Leberfibrose charakteristisch sind, wie z. B. die Anhäufung von ECM-Proteinen, die durch HSCs induziert werden [26].  Leberorganoide und Sphäroide unterschiedlicher zellulärer Zusammensetzung wurden erfolgreich eingesetzt, um eine Vielzahl hepatobiliärer Erkrankungen in vitro zu reproduzieren, die Hepatotoxizität zu untersuchen und antifibrotische Arzneimittel zu testen [27].

Ziel dieser Studie ist es, verschiedene 3D-Modelle der Leberfibrose zu entwickeln, die aus Hepatozyten und HSCs bestehen. Anhand dieser 3D-Modelle haben wir das antifibrotische Potenzial von EVs untersucht, die aus BM-MSCs und UC-MSCs isoliert und unter chemisch definierten Bedingungen kultiviert wurden.

2. Materialien und Methoden :  

    2.1. Zellkultur :  

Humane BM-MSCs und UC-MSCs wurden von RoosterBio (Frederick, MD, USA) bereitgestellt. Von jeder Zellquelle wurden drei verschiedene xenofreie Chargen verwendet. Nach dem Auftauen wurden die Zellen in einer Konzentration von 3000 Zellen/cm2 in T75-Zellkulturflaschen (Sarstedt, Mailand, Italien) ausgesät, mit 0,1 ml/cm2 2,5 µg/mL Vitronectin (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA) in Phosphatpuffersalzlösung (PBS) beschichtet, im RoosterNourish™- MSC-XF-Medium expandiert und bis zur Passage 6 verwendet.

Primäre Hepatozyten (UpHep), die von Upcyte® (Hamburg, Deutschland) erworben wurden, wurden in einer Konzentration von 10.000 Zellen/cm2 in T75-Zellkulturflaschen ausgesät, die mit 0,1 mL/cm2 50 µg/mL Kollagen Typ I (Gibco) in 20 mM Essigsäure beschichtet waren. Die UpHep-Zellen wurden in einem Hochleistungsmedium gehalten und bis zur zweiten Passage verwendet. HepG2-Zellen wurden in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Euroclone, Pero, MI, Italien) gehalten, das mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 2 nM L-Glutamin (beides von Euroclone, Pero, MI, Italien) ergänzt wurde. Die humane HSC-Linie LX-2 [28] (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) wurde in DMEM mit hohem Glukosegehalt (4,5 g/L, Euroclone) kultiviert, das 2 % fötales Kälberserum und 2 nM L-Glutamin enthielt, und bis zur sechsten Passage verwendet.

    2.2.  EV-Isolierung :  

Für die EV-Sammlung wurden BM-MSCs und UC-MSCs mit einer Dichte von 3000 Zellen/cm2 bzw. 2000 Zellen/cm2 in Vitronectin-beschichteten T75-Zellkulturflaschen ausgesät. Nach Erreichen einer Konfluenz von 70-80 % wurden die Zellen mit steriler Kochsalzlösung gewaschen und 24 Stunden lang in einem chemisch definierten RoosterCollect™-EV-Medium kultiviert. Anschließend wurde der Zellüberstand gesammelt, 15 Minuten lang bei 3000*g und 4 ◦C zentrifugiert und mit 0,22-µm-Filtern mikrofiltriert. Nach dem Entfernen von Zelltrümmern und apoptotischen Körpern wurde das gefilterte Medium in Zentrifugenflaschen aus Polycarbonat (Beckman Instruments, Brea, CA, USA) überführt und anschließend bei 100.000*g für 2 h bei 4 ◦C ultrazentrifugiert (Beckman Coulter Optima L-100K). Die resultierenden EVs wurden in PBS verdünnt und einer weiteren Ultrazentrifugation bei 100.000*g für 2 Stunden bei 4 ◦C unterzogen, um Proteinverunreinigungen zu reduzieren. Das endgültige EV-Pellet wurde in PBS mit 1 % Dimethylsulfoxid (DMSO, Sigma Aldrich) resuspendiert und bis zur Verwendung in nachfolgenden Experimenten bei -80 ◦C gelagert.

Das NanoSight NS300 Gerät (NanoSight Ltd., Amesbury, UK) wurde verwendet, um die Konzentration und Größenverteilung von EVs unter konstanten Flussbedingungen (Flussrate = 30) zu bewerten. Für jede EV-Probe wurden drei 60-Sekunden-Videos aufgezeichnet, und die Daten wurden mit der Software Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) 3.2 verarbeitet.

Die Charakterisierung des EV-Phänotyps erfolgte mittels zytofluorimetrischer Analyse nach bereits etablierten Protokollen [19,29,30]. Mit dem humanen MACSPlex Exosome Kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland) wurden etwa 1*109 EVs aus drei Chargen von BM-MSC-EVs und UC-MSC-EVs untersucht. Nach Inkubation mit den MACSPlex Exosome Capture Beads und Gegenfärbung mit APC-konjugierten Antitetraspanin-Antikörpern wurden die EV-Proben mit einem Cytoflex (Beckman Coulter) analysiert. Die mediane Fluoreszenzintensität (MFI) jeder Capture-Bead-Untergruppe wurde mit der CytExpert Software (Version 2.0, Beckman Coulter) bestimmt. Dazu wurde die MFI einer Leerwertkontrolle (Hintergrundfluoreszenzintensität) von der MFI aller 39 Capture-Bead-Subsets abgezogen. Der sich daraus ergebende MFI wurde dann auf der Grundlage des durchschnittlichen MFI der exosomalen Marker CD63, CD81 und CD9 normalisiert.

Größe und Integrität der EVs wurden mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie bewertet. Ungefähr 3*109 EVs wurden auf mit Nickel-Formvar-Kohle beschichtete 200-Mesh-Gitter (Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA) aufgebracht und durften 20 Minuten lang haften, wobei zuvor etablierte Protokolle befolgt wurden [31]. Anschließend wurden die Gitter mit PBS gewaschen, bevor sie mit einer 2,5 %igen Glutaraldehydlösung mit 2 % Saccharose inkubiert und anschließend gründlich mit destilliertem Wasser abgespült wurden. [...] 

    2.3  Aktivierung der hepatischen Stellat-Zellen :  

LX-2-Zellen wurden 6 Stunden lang in einem Serum-entzogenen Medium mit 0,2 % Rinderserumalbumin (Sigma Aldrich) synchronisiert und anschließend in einer Dichte von 13.000 Zellen/cm2 ausgesät. Um eine Aktivierung zu induzieren, wurden die LX-2-Zellen 6 h lang mit TGF-β1 (Sigma-Aldrich, 10 ng/mL) behandelt. Anschließend wurden die aktivierten LX-2-Zellen 24 h lang 50.000 EVs pro Zelle ausgesetzt und anschließend für die RNA-Extraktion lysiert.

    2.4.    Erzeugung von Leber-Sphäroiden :  

Für die Herstellung von Leber-Sphäroiden verwendeten wir die Sphericalplate 5D® (Kugelmeiers, Erlenbach, Schweiz), eine Platte mit 24 Vertiefungen, die speziell für die Aufnahme von jeweils bis zu 750 Sphäroiden konzipiert wurde. Ein ml/Vertiefung Medium wurde verwendet, um vor der Aussaat Luftblasen aus der Platte zu entfernen. Zur Herstellung von UpHep- oder HepG2-Sphäroiden wurden 150 Zellen/µW in Anwesenheit von TGF-β1 (10 ng/mL) mit einem Gesamtvolumen von 2 ml vollständigem Medium pro Well ausgesät. Um Sphäroide aus einer Co-Kultur von UpHep- oder HepG2- und LX-2-Zellen zu erzeugen, wurden die Zellen in einem Verhältnis von 10: 1 gemischt, bevor sie in Gegenwart von TGF-β1 ausgesät wurden. Für die Versuchsanordnung wurden die Sphäroide an den Tagen 1, 2, 3 und 6 nach der Aussaat entnommen. In ausgewählten Experimenten durften sich die Sphäroide 24 und 48 Stunden lang vor der EV-Stimulation absetzen und bilden. Zwei Dosen von BM-MSC-EVs und UC-MSC-EVs wurden getestet: 2 *108 EVs/Well (EV1; 2000 EVs/Zelle) und 1*109 EVs/Well (EV2; 8000 EVs/Zelle). Die Sphäroide wurden bis zum 6. Tag nach der Aussaat mit EVs inkubiert, dann mit PBS gewaschen und für die RNA-Extraktion lysiert.

    2.5.  Molekulare Analyse :  

Die RNA wurde mit dem miRNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) aus den Zellen isoliert und in cDNA umgewandelt, wie beschrieben [21]. Das 96-Well QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific) wurde für die quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) verwendet, die wie zuvor beschrieben durchgeführt wurde [21]. Die sequenzspezifischen Oligonukleotid-Primer (100 nM, bezogen von MWG-Biotech, Eurofins Scientific, Brüssel, Belgien) sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die relativen Veränderungen der Genexpressionswerte wurden mit der ∆∆Ct-Methode bestimmt, wobei TBP als Referenzgen diente.

Tabelle 1. In der RT-PCR verwendete Primer.

Gene	Vorwärts Primer Sequenz	Umgekehrte Primer-Reihenfolge
ACTA2 ALB COL1A1 CYP1A1 CYP3A4 TBP TGFB1	TGGCTATTCCTTCGTTACTACTGCT TTATGCCCCGGAACTCCTTT CAAGAGGAAGGCCAAGTCGAG GGGCGTTCTGTCTTTGTAA AATCTGTGCCTGAGAACACCAGA TGTGCACAGGAGCCAAGAGT GACTACTACGCCAAGGAGGT	CTCATTTTCAAAGTCCAGAGCTACAT ACAGGCAGGCAGCTTTATCAG TTGTCGCAGACGCAGATCC TGGGTTGACCCATAGCTTCT AGTCCATTGGATGAAGCCCA ATTTTCTTGCTGCCAGTCTGG GGAGCTCTGATGTGTTGAAG

 

    2.6.  Western Blot :  

Für die Proteinanalyse wurden die Zellen und EVs auf Eis mit dem Lysepuffer 17 lysiert, der 10 µg/mL Aprotinin, 10 µg/mL Leupeptin und 10 µg/mL Pepstatin (alle von R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA) enthält, und zwar gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Proteinkonzentration wurde mit dem BCA Protein Assay Kit (Pierce™ Thermo Fisher Scientific) quantifiziert. Die Proteine wurden durch Elektrophorese in 4-20%igen Polyacrylamidgelen aufgetrennt und auf Nitrocellulosemembranen übertragen, wie zuvor beschrieben. Die Blockierung der Membranen erfolgte in Clear Milk Blocking Buffer (Pierce™ Thermo Fisher) für 2 Stunden bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 4 ◦C mit primären Antikörpern, die alle von Cell Signaling Technologies (Danvers, MA, USA) stammen und in Tabelle 2 aufgeführt sind. Nach einer einstündigen Inkubation mit geeigneten Peroxidase-konjugierten sekundären Antikörpern (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) wurden Chemilumineszenzsignale mit SuperSignal™ West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher Scientific) entwickelt und mit dem Chemidoc-Gerät (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) visualisiert.

Tabelle 2. Für den Proteinnachweis verwendete Antikörper.

Antikörper	Code	Quelle
Primäres Anti-Alix Primäres Anti-CD9 Primäres Anti-CD63 Primäres Anti-CD81 Primäres Anti-GM130 Primäres Anti-TSG101 Sekundäres Anti-Maus Sekundäres Anti-Kaninchen	CST#2171 CST#13174 CST#52090 CST#56039 CST#12480 CST#72312 Invitrogen #31430 Invitrogen #31462	Maus Kaninchen Kaninchen Kaninchen Kaninchen Kaninchen Ziege Ziege

 

    2.7.  Immunfärbung :  

Sechs Tage nach der Aussaat wurden die Sphäroide von der Sphericalplate 5D® entnommen und über Nacht in Kammer-Objektträger (Corning, Glendale, AZ, USA) ausgesät. Am nächsten Tag wurden die Sphäroide mit PBS gespült und mit 2 % Paraformaldehyd für 30 Minuten bei 4 ◦C fixiert. Nach einem 30-minütigen Blockierungsschritt in PBS mit 5 % Rinderserumalbumin (Sigma Aldrich) wurden die Sphäroide 1 Stunde lang mit einem primären Antikörper gegen Kollagen I alpha 1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Sphäroide 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit einem Alexa-Fluor-488-konjugierten Sekundärantikörper (Molecular Probes, Invitrogen, Eugene, OR, USA) inkubiert. Sphäroide, die nur mit dem sekundären Antikörper gefärbt wurden, dienten als Kontrollen. Der Farbstoff Hoechst 33258 (Sigma Aldrich) wurde für die Kernfärbung verwendet. Die fluoreszenzmikroskopische Analyse wurde mit einem Zeiss Apotome Mikroskop (Carl Zeiss International, Jena, Deutschland) durchgeführt.

    2.8.  Statistische Auswertungen :  

Für die Datenanalyse wurde GraphPad Prism v.8.0 verwendet. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben. Die statistische Signifikanz wurde mittels ANOVA und anschließendem Dunnett-Test für multiple Vergleiche ermittelt, wobei ein p-Wert von <0,05 als signifikant angesehen wurde.

3.  Ergebnisse :  

    3.1.  Bildung von Lebersphäroiden mit HepG2 und LX-2 :  

Leber-Sphäroide wurden durch Co-Kultivierung einer Hepatozyten-Surrogat-Zelllinie (HepG2) mit menschlichen HSCs (LX-2) im Verhältnis 10:1 in einer Sphericalplate 5D® erzeugt (Abbildung 1A). Dieses spezielle Kultursystem ermöglichte die schnelle Bildung von Lebersphäroiden. Als Kontrolle haben wir Lebersphäroide nur aus HepG2-Zellen gebildet. In beiden Modellen begannen die Leberzellen innerhalb von 24 Stunden nach der Aussaat zu aggregieren und behielten ihre 3D-Sphäroidstrukturen bis zum sechsten Tag nach der Aussaat bei. In dieser Zeit wurden, abgesehen von einer leichten Zunahme der Sphäroidgröße, keine erkennbaren Veränderungen der Morphologie beobachtet (Abbildung 1B).

Wie im Arbeitsablauf (Abbildung 1A) dargestellt, induzierten wir eine Fibrose, indem wir Lebersphäroide, die durch die Co-Kultur von HepG2 und LX-2 oder HepG2 gebildet wurden, TGF-β1 aussetzten. Morphologische und molekulare Veränderungen wurden dann bis zum sechsten Tag der Kultur bewertet, und nur in den Sphäroiden, die durch die Co-Kultur gebildet wurden, wurde ein reduziertes Wachstum nach TGF-β1-Exposition beobachtet (Abbildung 1B). In Sphäroiden, die von HepG2 und LX-2 gebildet wurden, führte die TGF-β1-Behandlung zu einer erhöhten Expression der Fibrotikmarker COL1A1 und TGF-β1, während keine signifikanten Unterschiede in der α-SMA-Expression beobachtet wurden (Abbildung 1C). Interessanterweise exprimierten Sphäroide, die ausschließlich von HepG2 gebildet wurden, COL1A1 nicht per se, und die TGF-β1-Stimulation erhöhte die Expressionswerte von TGF-β1, während sie die COL1A1-Expression nicht beeinflusste (Abbildung 1C). Darüber hinaus bestätigte eine Immunfluoreszenzanalyse unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie die TGF-β1-induzierte Hochregulierung der Kollagen I-Expression in den Sphäroiden der Co-Kultur (Abbildung S1A). Diese Ergebnisse deuten insgesamt darauf hin, dass TGF-β1 einen fibrotischen Phänotyp in Leber-Sphäroiden induzieren kann, die durch die Co-Kultur von HepG2 und LX-2 erzeugt wurden.

Abb.1. Cont

Abbildung 1. Aufbau von Lebersphäroiden unter Verwendung von HepG2 und LX-2 (A) Diagramm zur Veranschaulichung des in vitro durchgeführten Versuchsaufbaus zur Erzeugung von Lebersphäroiden unter Verwendung der Co-Kultur von HepG2 und LX-2 oder nur HepG2; erstellt mit BioRender.com. (B) Morphologische Beobachtung der Lebersphäroide im Lichtmikroskop von Tag 1 bis Tag 6 nach der Zellaussaat (Maßstabsleiste, 100 µm). (C) Quantitative RT-PCR-Analyse der profibrotischen Genexpression in Lebersphäroiden bis zu 6 Tage nach der Aussaat. Die Expressionswerte wurden auf das TBP-Referenzgen normalisiert. Lebersphäroide von HepG2 und LX-2, die nicht durch TGF-β1 aktiviert wurden, dienten als Referenzkontrolle. Die Daten von mindestens drei unabhängigen Experimenten wurden mit Hilfe eines Zwei-Wege-ANOVA-Tests ausgewertet: * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001; und **** p < 0,0001.

    3.2.    Bildung von Lebersphäroiden mit UpHep und LX-2 :  

Es wurde auch ein 3D-Modell mit primären Hepatozyten erstellt. Wie in Abbildung S2A zu sehen ist, wies UpHep in der 2D-Kultur eine heterogene Morphologie auf, mit polygonalen und spindelförmigen Zellen. Diese gemischte Population könnte nicht nur reife Hepatozyten, sondern auch andere Leberzellen umfassen, die eine fibroblastenähnliche Morphologie aufweisen und COL1A1 und α-SMA auf mRNA-Ebene exprimieren, was den Merkmalen von HSCs ähnelt (Abbildung S2B). Darüber hinaus zeigten UpHep, die als Sphäroide kultiviert wurden, im Vergleich zur 2D-Kultur eine geringere Expression von Fibrose-assoziierten Genen (Abbildung S2B). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die 3D-Kultur es der HSZ-Population in UpHep ermöglicht, einen Ruhezustand aufrechtzuerhalten. Im Gegensatz dazu fördert die 2D-Kultur eher die Aktivierung der HSZ, wie die höhere Expression von COL1A1 und α-SMA zeigt. Verglichen mit der 2D-Kultur zeigten UpHep, die als Sphäroide kultiviert wurden, einen signifikanten Anstieg der Expression des Hepatozytenmarkers CYP1A1 ab dem ersten Tag der 3D-Kultur (Abbildung S2C). Außerdem stieg die Expression der Hepatozytenmarker Albumin und CYP3A4 in UpHep-Sphäroiden ab dem zweiten Tag der Kultur signifikant an (Abbildung S2C). Diese Daten deuten darauf hin, dass eine 3D-Kultur die Hepatozytendifferenzierung effektiver fördern kann als eine 2D-Kultur.

Wir erzeugten Leber-Sphäroide in einer Sphericalplate 5D®, indem wir UpHep mit LX-2-Zellen in einem Verhältnis von 10:1 kultivierten (Abbildung 2A). Als Kontrolle wurden auch Lebersphäroide, die nur aus UpHep bestanden, hergestellt. Ähnlich wie beim vorherigen 3D-Modell begannen die Leberzellen innerhalb von 24 Stunden nach der Aussaat zu aggregieren und behielten ihr 3D-Sphäroid-Aussehen bis zum sechsten Tag nach der Aussaat bei. Während dieses Zeitraums wurden keine signifikanten morphologischen Veränderungen in den Sphäroiden beobachtet (Abbildung 2B).

Abb.2. Cont.

Abbildung 2. Aufbau von Lebersphäroiden unter Verwendung von UpHep und LX-2 (A) Diagramm zur Veranschaulichung des in vitro durchgeführten Versuchsaufbaus zur Erzeugung von Lebersphäroiden unter Verwendung der Co-Kultur von UpHep und LX-2 oder nur UpHep; erstellt mit BioRender.com. (B) Morphologische Beobachtung im Lichtmikroskop von Lebersphäroiden von Tag 1 bis Tag 6 nach der Zellaussaat (Maßstabsleiste, 100 µm). (C,D) Quantitative RT-PCR-Analyse zur Bewertung der Expression von profibrotischen (C) und hepatozytenspezifischen (D) Genen in Lebersphäroiden bis zu 6 Tage nach der Aussaat. Die Expressionswerte wurden auf das Referenzgen TBP normalisiert. Lebersphäroide von UpHep, die nicht durch TGF-β1 aktiviert wurden, dienten als Referenzkontrolle. Die Daten von mindestens drei unabhängigen Experimenten wurden mit Hilfe eines Zwei-Wege-ANOVA-Tests ausgewertet: * p < 0,05; ** p < 0,01;*** p < 0,001; und **** p < 0,0001.

Um eine Fibrose in den Lebersphäroiden zu induzieren, wurden die Leberzellen in Gegenwart von TGF-β1 ausgesät (Abbildung 2A). Morphologische und molekulare Veränderungen wurden bis zum sechsten Tag der Kultur ausgewertet, und es wurden keine signifikanten Veränderungen im Wachstum nach der Exposition gegenüber TGF-β1 beobachtet (Abbildung 2B). Die Behandlung mit TGF-β1 führte zu einer erhöhten Expression der fibrotischen Marker COL1A1 und TGF-β1 auf mRNA-Ebene (Abbildung 2C). Die Immunfluoreszenzanalyse der von UpHep gebildeten Sphäroide bestätigte eine durch TGF-β1 induzierte erhöhte Expression von Kollagen I (Abbildung S1B). Bemerkenswert ist, dass die TGF-β1-Stimulation die Expression von αSMA ausschließlich in den von UpHep gebildeten Sphäroiden erhöhte, was darauf hindeutet, dass HSCs in UpHep vorhanden sein könnten und bei TGF-β1-Exposition einen aktivierten Phänotyp annehmen (Abbildung 2C).

Darüber hinaus wurde die Expression von Albumin und anderen hepatozytenspezifischen Enzymen (CYP1A1 und CYP3A4) in hepatischen Sphäroiden durch TGF-β1-Stimulation signifikant unterdrückt (Abbildung 2D). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass TGF-β1 einen fibrotischen Phänotyp in Lebersphäroiden mit einer Beeinträchtigung der Leberfunktion induzieren kann, insbesondere in jenen Sphäroiden, die ausschließlich durch UpHep erzeugt wurden, was wir in den nachfolgenden Experimenten zu verwenden beschlossen.

     3.3.    Charakterisierung von EVs :  

Die aus BM-MSCs und UC-MSCs gewonnenen EVs wurden gemäß den ISEV-Leitlinien charakterisiert [32]. Eine NTA-Analyse ergab eine mittlere Größe der EVs, die mit der von Exosomen und Mikrovesikeln vergleichbar war, während eine TEM-Analyse bestätigte, dass die EV-Präparate intakte nanoskalige Partikel mit Doppelmembranen enthielten (Abbildung 3A,B).

Eine durchflusszytometrische Analyse (Abbildung 3C, D) und eine Western-Blot-Analyse (Abbildung 3E) zeigten, dass die EVs die typischen exosomalen Marker ALIX, TSG101, CD9, CD63 und CD81 exprimierten. Der mesenchymale Ursprung der EVs wurde durch das Vorhandensein der Oberflächenmoleküle CD29, CD44, CD105 und CD146 bestätigt, die für MSCs charakteristisch sind. Außerdem war die Expression der Stammzellmarker MCSP und SSEA-4 in UC-MSC-EVs höher als in BM-MSC-EVs. Beide EV-Populationen wiesen keine Expression der Epithelmarker Ep-CAM/CD326 und CD24, hämatopoetischer Marker (CD45) und endothelialer Marker (CD31) oder humaner Leukozytenantigene (HLA) der Klasse I und II auf (Abbildung 3C,D).

 

Abbildung 3. Charakterisierung von BM-MSC-EVs und UC-MSC-EVs. (A,B) Repräsentative Diagramme, die die Größenverteilung der EVs mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse veranschaulichen (die roten Linien zeigen den Mittelwert der drei aufgenommenen Videos), neben mikroskopischen Aufnahmen der Transmissionselektronenmikroskopie, die intakte BM-MSC-EVs (A) und UC-MSC-EVs (B) zeigen. Die EVs wurden mit NanoVan negativ angefärbt (Maßstabsbalken, 200 nm). (C,D) Die molekularen Oberflächenprofile von BM-MSC-EVs (C) und UC-MSC-EVs (D) wurden mit einem Multiplex-Bead-basierten Durchflusszytometrie-Assay untersucht. Exosomale Marker und mesenchymale Marker sind durch schwarze bzw. hellblaue Balken gekennzeichnet. Die beiden Diagramme zeigen eine Quantifizierung der mittleren APC-Fluoreszenzwerte für 39 verschiedene Bead-Populationen nach der Hintergrundkorrektur. Es wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den drei verschiedenen Präparationen von BM-MSC-EVs und UC-MSC-EVs festgestellt. (E) Repräsentative Western-Blot-Analyse, die das Vorhandensein von exosomalen Markern in EVs zeigt. Der cis-Golgi-Marker GM130, der in EVs nicht vorhanden ist, aber in Zellen exprimiert wird, diente als negative Kontrolle.

    3.4.  EVs verringerten Fibrose in Leber-Sphäroiden :  

Wir untersuchten die Wirkung von EVs auf Lebersphäroide, die aus HepG2- und LX-2-Zellen bestehen, sowie auf Lebersphäroide, die von UpHep gebildet wurden. In beiden 3D-Modellen wurden Lebersphäroide mit zwei verschiedenen Dosen von EVs (EV1 = 2*108 EVs/Well und EV2 = 1*109 EVs/Well) aus BM-MSC und UC-MSC 24 h und 48 h nach der Aussaat behandelt. Anschließend wurden die Sphäroide am sechsten Tag der Kultur analysiert (Abbildung 4A). Die Verabreichung von EVs hatte keine erkennbaren Auswirkungen auf den Wachstumsstatus von TGF-β1-behandelten Lebersphäroiden (Abbildung S3A). Auf RNA-Ebene konnte die Behandlung mit der höchsten Dosis von EVs aus BM-MSC und UC-MSC die Expression von COL1A1 und TGF-β1 in HepG2- und LX-2-Sphäroiden (Abbildung 4B) abschwächen und die Expression von αSMA in UpHep-Sphäroiden (Abbildung 4C) reduzieren. Die Herunterregulierung von Kollagen I und αSMA wurde auch auf Proteinebene in HepG2- und LX-2-Sphäroiden (Abbildung 4D) und in UpHep-Sphäroiden (Abbildung 4E) beobachtet. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die EVs in den getesteten Dosierungen in der Lage sind, den durch TGF-β1 induzierten fibrotischen Phänotyp in Lebersphäroiden abzuschwächen. Schließlich hat die Behandlung mit EVs die Expression von Albumin und Leberenzymen in TGF-β1-behandelten primären Hepatozyten-Sphäroiden nicht signifikant verändert (Abbildung S3B).

Abbildung 4. Antifibrotische Wirkung von EVs auf hepatische Sphäroide, die mit TGF-β1 behandelt wurden. (A) Diagramm zur Veranschaulichung des experimentellen Aufbaus, der in vitro durchgeführt wurde, um die Auswirkungen von EVs aus BM-MSCs und UC-MSCs auf Sphäroide zu bewerten, die mit HepG2 und LX-2 oder nur UpHep erzeugt wurden; erstellt mit BioRender.com. (B,C) Quantitative RT-PCR-Analyse zur Bewertung der Expression profibrotischer Gene in Sphäroiden, die mit HepG2 und LX-2 (B) oder nur mit UpHep (C) nach Stimulation mit EVs aus BM-MSCs und UC-MSCs erzeugt wurden. Die Expressionswerte wurden auf das TBP-Referenzgen normalisiert. (D,E) Quantifizierung der Proteinbanden und repräsentative Bilder aus der Western-Blot-Analyse, die profibrotische Marker in Sphäroiden zeigen, die von HepG2 und LX-2 (D) oder nur UpHep (E) gebildet wurden. Die Intensitäten der Proteinbanden wurden auf die Vinculin-Expression normalisiert. Die Referenzkontrollen aller Experimente bestanden aus Lebersphäroiden, die mit TGF-β1 (10 ng/mL) aktiviert, aber nicht mit EVs behandelt wurden. Die Negativkontrolle (CTR) bestand aus Leber-Sphäroiden, die in Abwesenheit von TGF-β1 kultiviert wurden. Die Daten von mindestens drei unabhängigen Experimenten wurden mit einem Zwei-Wege-ANOVA-Test analysiert: * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001; und **** p < 0,0001.

    3.5.   EVs milderten den aktivierten Phänotyp von HSCs :

Um zu untersuchen, wie EVs den aktivierten Zustand von HSCs beeinflussen, wurden LX-2-Zellen, die durch TGF-β1 aktiviert wurden, mit EVs behandelt, die entweder aus BM-MSCs oder UC-MSCs gewonnen wurden, gemäß dem in Abbildung 5A beschriebenen Verfahren. Die Aktivierung von LX-2-Zellen durch TGF-β1 führte zu einer erhöhten Expression von zwei Fibrose-assoziierten Genen, α-SMA und COL1A1. Nach der Inkubation von LX-2-Zellen mit EVs sowohl von BM-MSCs als auch von UC-MSCs für 24 Stunden wurde jedoch ein signifikanter Rückgang der Expressionswerte von α-SMA und COL1A1 beobachtet (Abbildung 5B).

Abbildung 5. Antifibrotische Wirkung von EVs auf TGF-β1-aktivierte LX-2. (A) Diagramm zur Veranschaulichung des in vitro durchgeführten Versuchsaufbaus zur Bewertung der Wirkung von EVs aus BM-MSCs und UC-MSCs auf LX-2-Zellen; erstellt mit BioRender.com. (B) Quantitative RT-PCR-Analyse der profibrotischen Genexpression in LX-2-Zellen nach einer 24-stündigen Inkubationszeit mit EVs aus BM-MSCs und UC-MSCs. Die Expressionswerte wurden auf das Referenzgen TBP normalisiert. Die Referenzkontrolle bestand aus LX-2-Zellen, die mit TGF-β1 (10 ng/mL) aktiviert, aber nicht mit EVs behandelt wurden. Die Negativkontrolle (CTR) bestand aus LX-2-Zellen, die in Abwesenheit von TGF-β1 kultiviert wurden. Die Daten von mindestens drei unabhängigen Experimenten wurden mit Hilfe eines Zwei-Wege-ANOVA-Tests ausgewertet: * p < 0,05; ** p < 0,01; und **** p < 0,0001.

4.  Diskussion :  

Die Leberfibrose ist ein chronischer, fortschreitender und irreversibler Zustand, der durch eine Schädigung der Hepatozyten und einen Umbau der Gewebestruktur gekennzeichnet ist. Während die Leber als Reaktion auf akute Verletzungen in der Regel eine Regenerationsfähigkeit aufweist, lösen chronische Leberverletzungen anhaltende Entzündungs- und Wundheilungsreaktionen aus, die ihre Fähigkeit zur effektiven Regeneration beeinträchtigen [33]. Herkömmliche entzündungshemmende Behandlungen führen in den fortgeschrittenen Stadien einer chronischen Leberschädigung häufig nicht zu einer therapeutischen Reaktion. Obwohl bestimmte antifibrotische Medikamente und Stammzelltherapien nur begrenzt wirksam sind, versprechen neue Ansätze auf der Basis von Nanomedizin eine vielversprechende Prävention und Behandlung der Leberfibrose [11]. Vor allem EVs aus verschiedenen MSC-Quellen haben therapeutisches Potenzial bei fibrotischen Erkrankungen verschiedener Organe wie Herz, Nieren und Lunge gezeigt [34]. Insbesondere EVs aus BM-MSCs [35] und UC-MSCs [36-38] haben in präklinischen Leberfibrosemodellen eine schützende antifibrotische Wirkung gezeigt.

Es hat sich gezeigt, dass Priming-Strategien, die das zelluläre Umfeld von MSZ während der In-vitro-Expansion modulieren, die funktionellen Eigenschaften von MSZ und ihren EVs deutlich verbessern. Präkonditionierungstechniken wie hypoxische Präkonditionierung, Exposition gegenüber proinflammatorischen Zytokinen und 3D-Kulturumgebungen können das therapeutische Potenzial von MSC-EVs bei der Behandlung spezifischer pathologischer Zustände wie Leberfibrose verbessern [39]. Bei der hypoxischen Präkonditionierung werden MSC unter sauerstoffarmen Bedingungen kultiviert, wodurch der Hypoxie-induzierbare Faktor 1-alpha hochreguliert wird, was zur Sekretion von EVs mit verbesserten regenerativen Fähigkeiten führt [40,41]. Hypoxie-induzierte MSC-EVs sind mit angiogenen Faktoren angereichert und weisen eine erhöhte Fähigkeit auf, Gewebereparatur und Angiogenese zu fördern. Die Exposition gegenüber proinflammatorischen Zytokinen wie Tumor-Nekrose-Faktor-alpha und Interferon-Gamma veranlasst MSZ zur Produktion von EVs mit verbesserten entzündungshemmenden und immunmodulatorischen Eigenschaften [42,43]. Darüber hinaus produzieren MSZ, die in 3D-Umgebungen wie Sphäroiden oder gerüstbasierten Systemen kultiviert werden, aufgrund der erhöhten Sekretion bioaktiver Moleküle EVs mit besserer antifibrotischer Wirkung als solche aus 2D-Kulturen [44]. Die Optimierung dieser Priming-Techniken könnte die MSC-EV-Therapien bei Leberfibrose und anderen fibrotischen Erkrankungen erheblich voranbringen.

Um die Sicherheit und Wirksamkeit von EVs in einem zukünftigen klinischen Kontext zu gewährleisten, ist es notwendig, alle potenziellen Verunreinigungen in den Kulturmedien zu beseitigen. In dieser Hinsicht ist es vorzuziehen, keine Medien zu verwenden, die FBS oder menschliches Thrombozytenlysat enthalten, die ebenfalls eine potenzielle Quelle für EVs sein könnten [45]. Um die unbekannten Nebenwirkungen der in FBS vorhandenen EVs zu eliminieren, wird die Abreicherung von EVs aus FBS mittels Ultrazentrifugation und Hungerverfahren hauptsächlich zur Eliminierung von FBS während der MSC-EV-Sammlung eingesetzt [46]. Diese Methoden schließen jedoch das Vorhandensein von Proteinen und anderen Verunreinigungen tierischen Ursprungs im FBS nicht aus und berücksichtigen nicht die begrenzte Ausbeute der EV-Produktion unter Hungerbedingungen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, verwendeten wir MSC-Zellen und chemisch definierte, substanzfreie Medien, die von nicht-menschlichen Spezies stammen, für die EV-Isolierung [47,48].

MSC-EVs üben ihre antifibrotische Wirkung über mehrere potenzielle Mechanismen aus. MSC-EVs können eine Vielzahl bioaktiver Moleküle liefern, darunter Proteine, Lipide und RNAs, die nachweislich die zelluläre Reprogrammierung beeinflussen und die Differenzierung von Hepatozyten fördern und damit die Leberregeneration verbessern [49]. Ein weiteres zelluläres Ziel von MSC-EVs in der Leber sind HSCs, die eine zentrale Rolle bei der Fibrogenese der Leber spielen [3]. Die Aktivierung von HSCs gilt als Schlüsselereignis für das Fortschreiten der Leberfibrose [4]. Frühere Studien haben gezeigt, dass EVs, die aus MSCs aus dem Amnion [50] und aus MSCs aus der Plazenta [22] isoliert wurden, die Aktivierung von HSCs sowohl in vivo als auch in 2D- und 3D-In-vitro-Modellen der Leberfibrose hemmen. Wir haben bereits gezeigt, dass EVs aus HLSCs und BM-MSCs den aktivierten Phänotyp von HSCs in vitro abschwächen [21]. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen zeigte unsere Studie, dass die Behandlung mit EVs aus BM-MSCs und UC-MSCs, die in einem chemisch definierten Medium kultiviert wurden, zu einer Herunterregulierung der Expression fibrotischer Marker in aktivierten HSCs führte.

Die jüngsten Fortschritte bei 3D-Kultursystemen haben die Untersuchung komplexer Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen ermöglicht, die an der Fibroseprogression beteiligt sind, insbesondere Hepatozyten und HSCs. Humane primäre Hepatozyten gelten als der Goldstandard für die hepatologische Forschung [51]. Ihre Anwendung wird jedoch durch die begrenzte Verfügbarkeit von Lebergewebe, die hohen Kosten, die kurze Lebensdauer in Kultur und die erhebliche Variabilität zwischen verschiedenen Präparaten eingeschränkt [52]. Im Gegensatz dazu bieten Zelllinien Vorteile wie Verfügbarkeit, Robustheit und Reproduzierbarkeit. HepG2-Zellen zum Beispiel werden häufig in Hepatotoxizitätsstudien verwendet, können aber aufgrund des Fehlens von P450-Cytochrom-Enzymen keine stoffwechselvermittelte Hepatotoxizität nachweisen [53]. Kürzlich konnten mit Hilfe der Upcyte-Technologie menschliche Hepatozyten hergestellt werden, die zur Proliferation fähig sind und gleichzeitig bestimmte differenzierte Funktionen beibehalten [54].

In unserer Studie haben wir zwei verschiedene 3D-Leber-Sphäroide mit einer Hepatozyten-Surrogat-Zelllinie (HepG2) und HSCs oder UpHep hergestellt. In beiden 3D-Modellen konnten wir beobachten, dass sich die Leber-Sphäroide 24 Stunden nach der Aussaat selbst zusammensetzten und ihre strukturelle Integrität bis zu 6 Tage nach der Aussaat beibehielten. Die Behandlung mit TGF-β1 führte zu einer Hochregulierung fibrotischer Marker in Sphäroiden, die von HepG2- und LX-2-Zellen gebildet wurden, und in Sphäroiden, die von UpHep erzeugt wurden, was auf einen Übergang von einem normalen zu einem fibrotischen Phänotyp hindeutet.

Die Morphologie von UpHep wies eine erhebliche Heterogenität auf, die auf eine gemischte Population hinweist, die nicht nur reife Hepatozyten, sondern auch andere Leberzellen mit einer fibroblastenähnlichen Form umfasst. Darüber hinaus deutet die erhöhte Expression von profibrotischen Genen in UpHep-Sphäroiden nach TGF-β1-Stimulation darauf hin, dass UpHep keine reine Kultur von primären Hepatozyten ist und möglicherweise HSCs enthält. Folglich ist die Zugabe von LX-2-Zellen zu UpHep-Sphäroiden unnötig, da sie in der Kultur bereits vorhanden sein könnten. Im Gegensatz dazu führt die TGF-β1-Stimulation von Sphäroiden, die aus HepG2 gebildet wurden, nicht zu einem profibrotischen Phänotyp, so dass die Zugabe von LX-2-Zellen unerlässlich ist.

Anschließend testeten wir die Auswirkungen von EVs, die aus BM-MSCs und UC-MSCs stammen, auf Lebersphäroide, die HepG2- und LX-2-Zellen enthalten, sowie auf solche, die von UpHep gebildet wurden. Unsere Beobachtungen zeigten, dass die aus beiden Arten von MSZ isolierten EVs die durch TGF-β1 induzierte Expression von Fibrotikmarkern unterdrückten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass aus MSZ gewonnene EVs ein erhebliches Potenzial zur Abschwächung von Fibrose besitzen, was sich mit einer früheren Studie deckt, in der über die Fähigkeit von EVs aus plazentaren MSZ berichtet wurde, die TGF-β1-induzierte Expression von Fibrotomarkern in Leberorganoiden zu unterdrücken [22]. Die 3D-Versuchsbedingungen bestätigen die In-vivo-Studien, die den therapeutischen Einsatz von MSC-EVs als vielversprechende Behandlung für chronische Lebererkrankungen zeigten [55].

5.  Schlussfolgerungen  :  

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Verabreichung von EVs aus BM-MSCs und UC-MSCs antifibrotische Effekte in Lebersphäroiden zeigte. Diese therapeutischen Effekte sind wahrscheinlich auf die Inaktivierung von HSCs zurückzuführen, wie die verringerte Kollagenproduktion und αSMA-Expression zeigen. Daher stellt diese zellfreie Therapie eine vielversprechende Alternative für die Behandlung von chronischen Lebererkrankungen dar. Darüber hinaus hat das TGF-β1-induzierte Sphäroidmodell der Leber das Potenzial, ein wertvolles Instrument für das Screening von Medikamenten gegen Fibrose zu sein.

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