Protokoll für die Durchflusszytometrie an Vollblut

I. Erforderliches Material
Reagenzien
- Ein primärer Antikörper , gegen das Zielmolekül
- Ein  sekundärer Antikörper bei indirekter Färbung mit einem nicht markierten primären Antikörper
- Ein nicht relevanter Kontroll-Isotyp mit einer ähnlichen Markierung wie der primäre Antikörper

Puffer
- Ein Färbepuffer
- A Puffer für die Lyse von roten Blutkörperchen (RBC)
- Ein intrazellulärer Fixierungspuffer
- Trypanblau zum Zählen der Zellen
- Gaines-Mantelflüssigkeit

Material
- Pipetten und Pipetthilfe
- Zentrifuge
- Gefrierschrank
- Durchflusszytometer


II. Dauer des Versuchs
- 30 mn Probenvorbereitung und Antikörperverdünnungen
- 30 Minuten bis 1 Stunde Inkubation der Antikörper
- 30 Minuten bis 1 Stunde Probenlesung mit dem Durchflusszytometer (abhängig von der Anzahl der Proben, der Zellkonzentration und der Kapazität des Zytometers)
- TOTAL : 3 bis 4 Stunden


III. Protokoll
- Verdünnen Sie den primären Antikörper und den Kontroll-Isotyp in 50 µl Assay-Puffer, um die gewünschte Konzentration zu erreichen, die nach der Antikörpertitration optimiert wurde.
- Inkubation von 50 µl Zellpräparat in 50 µl Antikörperpräparat oder Kontroll-Isotyp in einer 96-Well-Platte
- 15-30 Minuten bei 4° C in einem dunklen Raum bebrüten

Hinweis : Sie müssen die Inkubationszeit der Antikörper im Hinblick auf ihre Affinität mit dem Antigen optimieren.

- 200 µl Assay-Puffer hinzufügen, um die Reaktion zu stoppen
- Zellen in Suspension 5 Minuten lang (300-400 g) bei +4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen
- Zweimalige Wiederholung der Waschschritte mit 200 µl Assay-Puffer - Zentrifugieren der Zellsuspension für 5 Minuten (300 - 400g) bei 4°c

Optional: Für indirekte Färbungen wiederholen Sie den Färbeschritt mit sekundären Antikörpern nach demselben Protokoll und mit ähnlichen Beobachtungen.
- In 2 ml Erythrozyten-Lysepuffer resuspendieren und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren
- 2 ml Assay-Puffer hinzufügen, um die Reaktion zu stoppen
- Zellsuspension 5 Minuten lang bei 4 °C zentrifugieren (300-400 g) und Überstand verwerfen
- Repeat twice the wash steps in 2 ml of assay buffer
- Wiederholen Sie die Waschschritte zweimal in 2 ml Assay-Puffer
- Zellen in einem Durchflusszytometer ablesen


IV. Search engines
- Primary antibodies
- Secondary antibodies