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Immunhistochemie (IHC) Allgemeines Protokoll

Immunhistochemie (IHC) Allgemeines Protokoll



I. Erforderliches Material
Reagenzien
- Ein primärer Antikörper , mit oder ohne Markierung, gegen das Zielmolekül
- Bausatz Offenbarung
- Chromogen

Puffer
- Xylol
- Alkoholfreie Bäder zu 70%, 80% und 95%
- Wasserstoffsuperoxyd (H2O2)
- Tris EDTA, Tris HCl
- Tween-20

Material
- Pipetten und Pipetthilfe
- Wasserbad


II. Dauer des Versuchs
- 10 mn Peroxydase-Blockierung
- 30 Minuten Antigenabruf
- 1 h Inkubation des primären Antikörpers
- 10 mn Inkubation des Chromogens
- 2 Stunden Spülschritte und Bäder
- TOTAL : 4 Stunden


III. Protokoll
- Entparaffinieren Sie den Schnitt in 3 Wechseln von Xylol für jeweils 5 Minuten.
- Waschen Sie den Abschnitt jeweils 5 Minuten lang in 96%igem, 80%igem und 70%igem Benzylalkohol.
- Mit destilliertem Wasser ausspülen.
- Blockieren Sie die endogene Peroxidase, indem Sie das Gewebe 10 Minuten lang in 3%igem Wasserstoffperoxid (H2O2) inkubieren.
- 5 Minuten lang in destilliertem Wasser waschen
- 5 Minuten lang in 0,05 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,6, ergänzt mit 0,2 % Tween-20 (Puffer A) waschen.
- Für konzentrierte Produkte: Inkubieren Sie den Schnitt mit dem in Puffer A verdünnten primären Antikörper in der Verdünnung 1:100 - 200 für 1 Stunde in der geschlossenen Nasskammer.
Für RTU-Produkte: Inkubieren Sie den Schnitt mit dem primären Antikörper (gebrauchsfertig) 1 Stunde lang in einer geschlossenen feuchten Kammer.
- Zweimal 5 Minuten mit Puffer A waschen.
- Tragen Sie den sekundären Antikörper auf (das Protokoll hängt vom Lieferanten ab), und fahren Sie mit den Standardverfahren fort immunohistochemistry protocol (HRP - Peroxide - DAB).
- Zweimal 5 Minuten mit Puffer A waschen.
- Auftragen des Chromogens (DAB), 10 Minuten.
- 10 Minuten lang in Wasser waschen.
- 5 Minuten lang in Hämatoxylin färben.
- 10 Minuten lang in Wasser waschen.
- Dehydrieren Sie den Schnitt in 2 Wechseln von 96%igem Benzylalkohol für jeweils 5 Minuten.
- Waschen Sie den Abschnitt in 2 Wechseln von Xylol für jeweils 2 Minuten.
- Montieren Sie den Objektträger zur Beobachtung.