Experimentelles Protokoll für Western Blotting

 

Proteintrennung durch Gel-Elektrophorese

Vor dem Western Blot müssen die Proteine in einer Probe nach ihrer Größe getrennt werden. Dies geschieht in der Regel mittels SDS-PAGE (Sodium Dodecyl-Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis), bei der die Konzentration des Polyacrylamids zusammen mit dem Puffersystem die Beweglichkeit der Proteine durch das Gel in Abhängigkeit von ihrem Molekulargewicht beeinflusst. Das Gel bei der SDS-PAGE besteht aus zwei verschiedenen Schichten, dem so genannten „Stapelgel“ (obere Schicht) und dem „Trenngel“ oder „Auflösungsgel“ (untere Schicht).

Wie in der nachstehenden Tabelle dargestellt, sollte die Konzentration des Auflösungsgels der Größe Ihres Zielproteins entsprechen.

Größe des Proteins (kDa)	Polyacrylamid-Konzentration
≥500	5%
25-200	8%
15-100	10%
10-70	12.5%
12-45	15%
4-40	20%

SDS-PAGE-Gele können gekauft oder auch leicht selbst hergestellt werden. Ein gängiges Rezept für die Herstellung eines SDS-PAGE-Gels lautet wie folgt. Wenn Sie ein vorgefertigtes Gel verwenden, fahren Sie mit dem nächsten Abschnitt fort.

Reagenzien	6% Stapelgel	10% Trenngel
ddH2O	2 mL	3 mL
1 M Tris-HCl	400 uL pH 6.7	2.1 mL pH 8.9
30% Acrylamid/Bis- Acrylamide	600 uL	2.8 mL
10% SDS	36 uL	80 uL
10% APS (Ammoniumpersulfat)	24 uL	50 uL
TEMED (TetraMethylEthyleneDiamine)	4 uL	6 uL

1. Bauen Sie das Gel-Gießset gemäß den Anweisungen des Herstellers zusammen. Dazu gehört das Einsetzen der Glasplatten in den Gießrahmen und das Einrasten.
2. Setzen Sie den Gießrahmen in den Gießständer ein. Platzieren Sie den Kamm an der richtigen Stelle.
3. Markieren Sie das Glas mit einem Marker ca. 1 cm unterhalb des Kamms. Dies zeigt die benötigte Menge an Trenngel an.
4. Entfernen Sie den Kamm. Geben Sie mit einer Pipette eine kleine Menge Wasser in die Gelkammer, um sicherzustellen, dass kein Wasser ausläuft. Entfernen Sie das Wasser mit einem KimWipe.
5. Mischen Sie alle Zutaten des Trenngels zusammen und fügen Sie TEMED zuletzt hinzu.
6. Pipettieren Sie das Trenngel in die Kammer bis zu Ihrer Markierung.
7. Um Blasen zu entfernen, pipettieren Sie vorsichtig eine kleine Menge Isopropylalkohol (IPS) auf die Oberseite des Gels. Lassen Sie das Gel 30 Minuten lang aushärten.
8. Entfernen Sie das IPA, indem Sie vorsichtig ein KimWipe in die Kammer einführen.
9. Mischen Sie alle Zutaten des Stapelgels und fügen Sie zuletzt TEMED hinzu.
10. Pipettieren Sie das Stapelgel in die Kammer bis zum oberen Rand der Glasplatte.
11. Setzen Sie Ihren Kamm ein. Lassen Sie das Gel weitere 30 Minuten aushärten.

 

Vorbereitung der Probe

Proteine werden in der Regel aus Zellen oder Geweben mit verschiedenen Extraktionspuffern extrahiert, die Detergenzien, Salze und Proteaseinhibitoren enthalten, um die Integrität und Stabilität der Proteine zu erhalten.

Die Menge des in der Probe vorhandenen Proteins wird nach folgenden Methoden geschätzt:

1. Direkte Methode auf der Grundlage der Absorption bei 280 nm durch UV-Spektroskopie.
2. Bradford-Protein-Assay (Bradford-Assay-Rechner)
3. BCA Protein Quantification Assay (Amplite® Colorimetric oder Amplite® Fluorimetric oder Portelite™ Fluorimetric Assay Kits).

Um die Proteine zu denaturieren und alle nicht-kovalenten Wechselwirkungen zu unterbrechen, wird dem Probenpuffer ein Reduktionsmittel wie β-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol (DTT) zugesetzt. Zusätzlich hilft das Erhitzen der Proben auf etwa 95°C für 5 Minuten oder auf 70°C für 10 Minuten, die Proteine vollständig zu denaturieren. Den Proteinproben wird ein Ladefarbstoff zugesetzt, um ihre Dichte zu erhöhen, sie farblich zu visualisieren und die Wanderung der Proben während der Elektrophorese zu verfolgen. Der Farbstoff enthält in der Regel einen Tracking-Farbstoff (z. B. Bromphenolblau oder Xylencyanol) und ein Verdichtungsmittel (z. B. Glycerin), das das Einsinken der Proben in die Vertiefungen unterstützt.

Gel-Elektrophorese

Benötigte Ausrüstung :

• ektrophoresekammer und Netzteile
• Mikropipette

Benötigte Reagenzien :

• SDS-PAGE-Gel
• 1X Laufpuffer (Rezept für 10X Laufpuffer)
• Protein-Proben
• Proteinleiter (PageTell™ vorgefärbte 10-250 kDa-Leiter oder ProLite™ 5-245 kD-Proteinleiter)

 

1. Setzen Sie die Gelkassette in die Elektrodenkammer ein. Setzen Sie die Elektrodenkammer in den Elektrophoresebehälter.
2. Entfernen Sie den Kamm auf dem Gel.
3. Geben Sie ~200 ml 1x Laufpuffer in die innere Elektrodenkammer.
4. Füllen Sie die äußere Kammer des Tanks bis zur Indikatormarkierung an der Außenseite des Tanks. Stellen Sie sicher, dass der Laufpuffer das Gel vollständig bedeckt.
5. Erhitzen Sie die Proben in einem Wasserbad bei 95°C für 5 Minuten oder bei 70°C für 10 Minuten.
6. Geben Sie Ihre Proben und Proteinleitern in die gekennzeichneten Vertiefungen. Das Volumen hängt von der Probe ab, liegt aber im Allgemeinen zwischen 5 und 15 uL pro Vertiefung. Das Volumen in jeder Lane sollte durch Verwendung von ddH20 oder Lysepuffer ausgeglichen werden.
7. Schließen Sie den Elektrophoresebehälter an Ihr Netzteil an, rot (+) an rot, schwarz (-) an schwarz.
8. Lassen Sie Ihr Gel mit der gewünschten Spannung und für die gewünschte Zeit laufen. In der Regel liegen diese Parameter bei 100 - 150 V für 40 bis 60 Minuten.

Das auf dem Gel abgetrennte Protein kann mit ProLite™ Orange Protein Gel Stain angefärbt werden, um das gesamte auf dem Gel vorhandene Protein sichtbar zu machen.

Elektrotransfer

Anschließend werden die auf dem Gel vorhandenen getrennten Proteine durch ein Verfahren namens Elektrotransfer (auch Elektroblotting) auf eine Membran übertragen.

Benötigte Ausrüstung :

• Übertragungsgerät
• Schwamm oder Schaumstoff, auf die gleiche Größe wie das Gel zugeschnitten
• 6 Filterpapiere, die auf die gleiche Größe wie das Gel zugeschnitten sind
• Montageplatte oder Blotting-Kassette

Benötigte Reagenzien :

• Eis
• Methanol
• PVDF- (Polyvinylidenfluorid) oder Nitrocellulosemembran, auf die gleichen Abmessungen wie das Gel zugeschnitten
• 1X Transferpuffer (Rezept für 20X Transferpuffer)

 

1. Befeuchten Sie den Schwamm, die Filterpapiere und die Membran mit Methanol.
2. Nehmen Sie das Gel vorsichtig aus der Gelkassette.
3. Bauen Sie vorsichtig ein Elektro-Transfer-Sandwich zusammen, indem Sie es in der folgenden Reihenfolge stapeln:

   • (a) Montage Tablettboden

   • (b) Druckschwamm

   • (c) Filterpapiere

   • (d) Gele

   • (e) PVDF-Membran

   • (f) Filterpapiere

   • (g) Montageplatte oben

4. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen im Sandwich vorhanden sind. Drücken Sie die überschüssige Flüssigkeit vorsichtig aus.
5. Legen Sie das Sandwich auf Eis in den Elektroblotting-Tank.
6. Geben Sie Transferpuffer in den Elektroblotting-Behälter und bedecken Sie das Sandwich vollständig.
7. Schließen Sie die Elektroblottingwanne an Ihr Netzteil an, rot (+) an rot, schwarz (-) an schwarz.
8. Lassen Sie das Elektroblotting-System für die gewünschte Dauer laufen, die zwischen 45 und 90 Minuten liegt.

 

Blockieren

Durch einen Blockierungsschritt wird verhindert, dass Antikörper unspezifisch an die Membran binden. Durch die Blockierung wird potenzielles Hintergrundrauschen von der Membran entfernt, was die Proteinanalyse vereinfacht. Häufig verwendete Blocker sind 2-5 % BSA oder fettfreie Trockenmilch in gepufferter Kochsalzlösung (TBS oder PBS).

Tabelle 1. Vergleich von Blocking-Puffern für Western Blotting.

Blockierpuffer	Vorteile	Überlegungen
Magermilch	Kostengünstig Enthält mehrere Arten von Proteinen	Enthält Biotin und Phosphoproteine, die mit Streptavidin-Biotin-Nachweisstrategien und dem Nachweis phosphorylierter Zielproteine interferieren können. Aufgrund der Vielzahl von Proteinen in der Milch kann die Milch einige Antigene maskieren und die Nachweisgrenze des Western Blot senken.
Gereinigte Proteine	Einzelprotein-Blockierungspuffer können das Risiko von Kreuzreaktionen mit Testkomponenten geringer halten als Serum- oder Milchlösungen. Ideal, wenn Blocker, wie fettfreie Milch, die Antigen-Antikörper-Bindung blockieren	Teurer als herkömmliche fettfreie Milchformulierungen.
Rinderserumalbumin (BSA)	Gute Alternative zu Milch Kann in Biotin-Streptavidin-Systemen oder beim Sondieren von Phosphoproteinen verwendet werden	Im Handel sind verschiedene BSA-Qualitäten erhältlich, die sich auf das Signal-Rausch-Verhältnis auswirken können. BSA ist im Allgemeinen ein schwächerer Blicker, was zu einer stärkeren unspezifischen Antikörperbindung führen kann, aber die Nachweisempfindlichkeit für Proteine mit geringem Vorkommen erhöhen kann.

 

Inkubation von primären und sekundären Antikörpern

Das Protein von Interesse in einem Western Blot kann entweder mit einem markierten primären Antikörper oder mit einem unmarkierten primären Antikörper und einem markierten sekundären Antikörper nachgewiesen werden.

1. Geben Sie den primären Antikörper in 5% BSA (Rinderserumalbumin) auf die Membran.
2. Inkubieren Sie die Membran über Nacht bei 4°C auf einem Schüttler oder für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
3. Wenn Sie einen sekundären Antikörper verwenden, waschen Sie die Membran dreimal mit TBST. Inkubieren Sie die Membran mit dem sekundären Antikörper für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
4. Waschen Sie die Membran dreimal mit TBST.

Erkennung

Beim Western Blotting werden Nachweismethoden eingesetzt, um das Vorhandensein bestimmter Proteine, die vom Gel auf die Membran übertragen wurden, sichtbar zu machen und zu quantifizieren. Je nach den spezifischen Anforderungen des Experiments und der Art der Markierung in Ihrem Detektionsantikörper können verschiedene Nachweismethoden eingesetzt werden.

Im Folgenden werden einige häufig verwendete Nachweismethoden beim Western Blotting vorgestellt:

Chemilumineszenz

Chemilumineszierende Substrate wie Amplite® West ECL HRP Substrate erzeugen Licht durch enzymatische Reaktion mit Meerrettichperoxidase (HRP) oder alkalischer Phosphatase (AP), die mit sekundären Antikörpern konjugiert sind. Es handelt sich um eine empfindliche Methode, die ein lang anhaltendes Signal liefert.

Fluoreszenz

Fluoreszenzmarkierte sekundäre Antikörper binden direkt an primäre Antikörper, oder primäre Antikörper werden mit Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörpern nachgewiesen. Dieser Ansatz ermöglicht Multiplexing-Funktionen, hohe Empfindlichkeit und Kompatibilität mit verschiedenen Bildgebungssystemen.

Der Leitfaden zur Auswahl von Antikörpern und Proteinmarkern kann bei der Planung von Western Blotting und anderen Immunoassays hilfreich sein, indem er Informationen zur Auswahl der am besten geeigneten Antikörper für spezifische experimentelle Anforderungen liefert.

Kolorimetrische Detektion

Enzymsubstrate erzeugen bei der Reaktion mit HRP oder AP, die mit sekundären Antikörpern konjugiert sind, ein farbiges Reaktionsprodukt, das zur Visualisierung von Proteinen im Western Blot verwendet werden kann.

Analyse

Bei der Western-Blot-Analyse werden die klaren Blot-Bilder mit speziellen Geräten aufgenommen. Die Bandenintensität kann mit einer Bildanalysesoftware quantifiziert werden, wobei für genaue Vergleiche häufig eine Normalisierung auf interne Kontrollen erfolgt. Statistische Tests bewerten die Unterschiede zwischen den analysierten Proben und helfen, aussagekräftige Schlussfolgerungen zu ziehen.

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