unbeschichteter ELISA

I. Erforderliches Material

Reagenzien
- Ein primärer Antikörper der für das Zielmolekül spezifisch ist
- Ein zweiter primärer Antikörpernachweis spezifisch für das Zielmolekül
- Ein rekombinantes Molekül zur Verwendung als Standard
- Detektionslösungen: z. B. Streptavidin-HRP und TMB

Puffer
- Beschichtungspuffer:  z. B. PBS
- Blockierungspuffer: z.B. PBS mit 5%BSA
- Waschpuffer: z.B. PBS mit 0,05 % Tween
- Verdünnungsmittel für Probe und Standard: z. B. PBS 1%BSA
- Stopplösung: z. B. verdünnte H2SO4

Material -  96-Well-Mikrotiterplatten
- Plattenabdeckungen/Dichtungen
- 5-ml- und 10-ml-Messpipetten
- 20 µl bis 1.000 µl einstellbare Einkanal-Mikropipetten mit Einwegspitzen
- 50 µl bis 300 µl einstellbare Mehrkanal-Mikropipette mit Einwegspitzen
- Mehrkanal-Mikropipettenreservoir
- Bechergläser, Flaschen, Zylinder, die für die Zubereitung von Reagenzien erforderlich sind
- Vorrichtung zur Abgabe der Waschlösung (Mehrkanal-Waschflasche oder automatisches Waschsystem)
- Mikrotiterplatten-Lesegerät, das bei 450 nm messen kann



II. Versuchszeitraum
- 1 bis 2 Stunden Etikettierung
- 3h des Verfahrens
- 30 Minuten mit verschiedenen Waschungen
- 10 Minuten Lesen
- TOTAL : 4 bis 5 Stunden


III. Verfahren
Beschichtung -  Verdünnen Sie den Capture-Antikörper mit Beschichtungspuffer auf die entsprechende Konzentration (wie im Beiblatt angegeben) (10 ml Endvolumen pro Platte erforderlich)
- 100 µl der Capture-Antikörperlösung in alle Vertiefungen der Platte geben, abdecken und über Nacht bei 4 °C inkubieren
- Saugen Sie den Inhalt jeder Vertiefung ab und waschen Sie die Platte dann mindestens zweimal mit 400 µl Waschpuffer in jeder Vertiefung.

Hinweis : Stellen Sie sicher, dass nach dem letzten Waschvorgang alle Pufferreste durch vorsichtiges Abtupfen auf saugfähigem Papier entfernt werden

- 250 µl der Blockierungslösung in alle Vertiefungen der Platte geben, abdecken und 2 Stunden bei RT inkubieren
- Saugen Sie den Inhalt jeder Vertiefung ab und waschen Sie die Platte mindestens zweimal mit 400 µl Waschpuffer in jeder Vertiefung; die Platte ist nun für den Test bereit.
Assay-Verfahren
- 100 µl der vorbereiteten Standard-, Proben- und Kontrollverdünnungen in die entsprechenden Vertiefungen geben, die Platte abdecken und mindestens 1 Stunde lang bei RT inkubieren
- Saugen Sie den Inhalt jeder Vertiefung ab und waschen Sie die Platte dann mindestens zweimal mit 400 µl Waschpuffer in jeder Vertiefung.
- 100 µl des verdünnten Detektionsantikörpers (Verdünnung gemäß Beipackzettel) in jede Vertiefung geben, die Platte abdecken und mindestens 1 Stunde bei RT inkubieren
- Saugen Sie den Inhalt jeder Vertiefung ab und waschen Sie die Platte dann mindestens zweimal mit 400 µl Waschpuffer in jeder Vertiefung.
- 100 µl der Streptavidin-HRP-Lösung in alle Vertiefungen geben, die Platte abdecken und 30 Minuten lang bei RT inkubieren.
- Aspirate the contents of each well, then wash the plate at least twice using 400 µl of wash buffer in each well
- Saugen Sie den Inhalt jeder Vertiefung ab und waschen Sie die Platte dann mindestens zweimal mit 400 µl Waschpuffer in jeder Vertiefung.
Hinweis: IDie Inkubationszeit der Substratlösung hängt in der Regel von der Leistung des ELISA-Lesegeräts ab. Viele ELISA-Lesegeräte zeichnen nur die Absorption bis zu 2,0 O.D. auf. Daher muss die Farbentwicklung in den einzelnen Mikrovertiefungen vom Analytiker beobachtet und die Substratreaktion gestoppt werden, bevor die positiven Vertiefungen nicht mehr im aufzeichnungsfähigen Bereich liegen.
- Geben Sie 100 µl Stopplösung in alle Vertiefungen und messen Sie innerhalb von 30 Minuten die Absorptionswerte bei 450 nm (wenn 620 nm als Referenzwellenlänge verfügbar ist, sind 610-650 akzeptabel).