vorbeschichteter ELISA

ELISA Kits
I. Erforderliches Material

Reagenzien
- Ein primärer Antikörpernachweis, spezifisch für das Zielmolekül
- Ein rekombinantes Molekül zur Verwendung als Standard
- Detektionslösungen: z. B. Streptavidin-HRP und TMB

Puffer
- Blocking Buffer: z.B. PBS mit 5%BSA
- Waschpuffer: z. B. PBS mit 0,05 % Tween
- Verdünnungsmittel für Probe und Standard: z. B. PBS 1%BSA
- Stopplösung: z. B. verdünnte H2SO4

Material - Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen, beschichtet mit Capture-Antikörper
- Plattenabdeckungen/Dichtungen

- 5-ml- und 10-ml-Messpipetten
- 20 µl bis 1.000 µl einstellbare Einkanal-Mikropipetten mit Einwegspitzen
- 50 µl bis 300 µl einstellbare Mehrkanal-Mikropipette mit Einwegspitzen
- Mehrkanal-Mikropipettenreservoir
- Bechergläser, Flaschen, Zylinder, die für die Zubereitung der Reagenzien erforderlich sind
- Vorrichtung zur Abgabe der Waschlösung (Mehrkanal-Waschflasche oder automatisches Waschsystem)
- Mikrotiterplatten-Lesegerät, das bei 450 nm messen kann



II. Versuchszeitraum
- 3h des Verfahrens
- 30 Minuten mit verschiedenen Waschungen
- 10 Minuten Lesen
- TOTAL : 4 Stunden


III. Verfahren
- 100 µl der vorbereiteten Standard-, Proben- und Kontrollverdünnungen in die entsprechenden Vertiefungen geben, die Platte abdecken und mindestens 1 Stunde lang bei RT inkubieren
- Saugen Sie den Inhalt jeder Vertiefung ab und waschen Sie die Platte dann mindestens zweimal mit 400 µl Waschpuffer in jeder Vertiefung.
- 100 µl des verdünnten Detektionsantikörpers (Verdünnung gemäß Beipackzettel) in jede Vertiefung geben, die Platte abdecken und mindestens 1 Stunde bei RT inkubieren
- Saugen Sie den Inhalt jeder Vertiefung ab und waschen Sie die Platte dann mindestens zweimal mit 400 µl Waschpuffer in jeder Vertiefung.
- 100 µl der Streptavidin-HRP-Lösung in alle Vertiefungen geben, die Platte abdecken und 30 Minuten lang bei RT inkubieren.
- Saugen Sie den Inhalt jeder Vertiefung ab und waschen Sie die Platte dann mindestens zweimal mit 400 µl Waschpuffer in jeder Vertiefung.
-100 µl der TMB-Lösung in alle Vertiefungen geben, die Platte abdecken und für mindestens 10 Minuten bei RT inkubieren.
Hinweis : Die Inkubationszeit der Substratlösung richtet sich in der Regel nach der Leistung des ELISA-Lesegeräts. Viele ELISA-Lesegeräte zeichnen nur die Absorption bis zu 2,0 O.D. auf. Daher muss die Farbentwicklung in den einzelnen Mikrovertiefungen vom Analytiker beobachtet und die Substratreaktion gestoppt werden, bevor die positiven Vertiefungen nicht mehr im aufzeichnungsfähigen Bereich liegen
- Geben Sie 100 µl Stopplösung in alle Vertiefungen und messen Sie innerhalb von 30 Minuten die Absorptionswerte bei 450 nm (wenn 620 nm als Referenzwellenlänge verfügbar ist, sind 610-650 akzeptabel).