Protokoll für intrazelluläre Durchflusszytometrie

I. Erforderliches Material
Reagenzien
- Ein  primärer Antikörper gegen das Zielmolekül
- Ein sekundärer Antikörper bei indirekter Färbung mit einem nicht markierten primären Antikörper
- Ein nicht relevanter Kontroll-Isotyp mit einer ähnlichen Markierung wie der primäre Antikörper

Puffer
- Ein Färbepuffer
- A Permeabilisierungspuffer

- Ein intrazellulärer Fixierungspuffer
Material
- Pipetten und Pipetthilfe
- Zentrifuge
- Gefrierschrank
- Durchflusszytometer


II. Dauer des Versuchs
- Stimulation von Zellen (je nach Zelltyp)
- 2 bis 3 Stunden Inkubation der Antikörper
- 30 Minuten bis 1 Stunde Probenlesung mit dem Durchflusszytometer (abhängig von der Anzahl der Proben, der Zellkonzentration und der Kapazität des Zytometers)
- TOTAL : 3 bis 4 Stunden


III. Protokoll
- Bereiten Sie die Zellen gemäß Ihrem Zellanpassungsprotokoll vor.
- Färben Sie die Zellen gemäß den allgemeinen Empfehlungen des Protokolls für Zellen in Suspension
- Nach dem ersten Waschen die Zellen mit 100 µl Fixierpuffer fixieren und die Röhrchen vortexen
- 20 Minuten lang bei Raumtemperatur in einem dunklen Raum inkubieren
-5 Minuten lang (300-400 g) bei 4 °C zentrifugieren
- 1 ml Permeabilisierungspuffer hinzufügen
- 5 Minuten lang (300-400 g) bei 4 °C zentrifugieren
- 20 µl des verdünnten primären Antikörpers in einer optimalen Konzentration (nach Angaben des Herstellers) von 0,5 bis 0,6 µg / 106 Zellen) in Permeabilisierungspuffer geben und vortexen
- Röhrchen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur bebrüten
- 1 ml Permeabilisierungspuffer hinzufügen
- 5 Minuten lang (300-400 g) bei 4 °C zentrifugieren
- Resuspendieren Sie die Zellen in 500 µl Assay-Puffer oder Fixierungspuffer mit 2% Formaldehydzusatz.
- Zellen in einem Durchflusszytometer ablesen


IV. Suchmaschine
- Primäre Antikörper
- Sekundäre Antikörper