Investigue la tecnología PhosphoSens para la medición precisa de la actividad de las cinasas y las fosfatasas
Descubra cómo la tecnología PhosphoSens® ofrece una solución para medir con precisión la actividad de las cinasas y las fosfatasas, ayudando a los investigadores a avanzar en su comprensión de la señalización celular y el desarrollo terapéutico.
La fosforilación y desfosforilación de proteínas son procesos bioquímicos fundamentales que regulan funciones celulares como la transducción de señales, la progresión del ciclo celular, el metabolismo y la expresión génica. Estos procesos son catalizados por dos clases de enzimas: quinasa y fosfatasa.
Las quinasas son enzimas clave en la regulación de las funciones celulares (Cheng et al., 2011). Estas enzimas están involucradas en procesos como el crecimiento celular, la diferenciación, el metabolismo, la proliferación y la muerte celular programada (Shchemelinin et al., 2006). El genoma humano codifica 518 quinasas diferentes, lo que las convierte en una de las familias de enzimas más grandes del cuerpo (Manning et al., 2002). Debido a su papel crucial en la señalización celular, las alteraciones en la actividad de las quinasas se han relacionado con numerosas enfermedades, incluyendo el cáncer y otros trastornos.
Las fosfatasas son enzimas que desempeñan un papel importante en la regulación celular al eliminar los grupos fosfato de los restos de aminoácidos fosforilados en las proteínas. Estas se dividen en diversas familias, según su estructura y sus mecanismos catalíticos.
Para comprender mejor las quinasas y fosfatasas y desarrollar terapias efectivas, es fundamental medir con precisión su actividad. Aquí es donde entran en juego herramientas como los ensayos PhosphoSens de AssayQuant. Esta plataforma permite una detección precisa y sensible de la actividad de quinasas y fosfatasas, esencial tanto para la investigación básica como para el desarrollo terapéutico.
Tecnología PhosphoSens®
El núcleo de la tecnología PhosphoSens® se basa en el método de fluorescencia mejorada por quelación (ChEF). Este método utiliza un aminoácido sintético con un derivado de 8-hidroxiquinolina (sulfonamidooxina, Sox). Sox se une a los iones de magnesio (Mg²⁺) e interactúa con los sitios de fosforilación en los sustratos de quinasa.
En el estado no fosforilado, Sox tiene una baja afinidad por Mg²⁺, lo que da lugar a una fluorescencia mínima. Sin embargo, cuando el sustrato se fosforila, la afinidad de Sox por Mg²⁺ aumenta, lo que produce una señal fluorescente fuerte. Esta fluorescencia puede ser monitoreada utilizando lectores de placas de fluorescencia convencionales, lo que permite una cuantificación sencilla de la actividad de la quinasa (Figura 1).
Figura 1: Mecanismo ChEF para la medición directa de la actividad de la quinasa
La Figura 2A muestra los cambios típicos de fluorescencia tras la fosforilación de un sustrato peptídico PhosphoSens y la Figura 2B muestra los espectros de excitación y emisión de un péptido PhosphoSens fosforilado típico. Las propiedades fluorescentes del ion Mg(II) coordinado con 8-hidroxiquinolina de Sox tienen un λExMax de ~360 nm (358-363 nm) y un λEmMax de ~492 nm (485-498 nm). Dado que el espectro de emisión fluorescente es relativamente ancho (ver Figura 2B), la emisión fluorescente en el rango de 475-508 nm se puede monitorear con una disminución de la intensidad de la señal de <7%.
Figura 2: Espectros de fluorescencia de los péptidos PhosphoSens
PhosphoSens® Quinasa y Fosfatasa
Los kits PhosphoSens®, que contienen el sustrato peptídico CSox, son compatibles con diferentes tipos de quinasas, tanto purificadas como aquellas presentes en muestras biológicas complejas. Esta flexibilidad hace que PhosphoSens® sea una herramienta excelente para diversas aplicaciones de investigación, desde la detección de inhibidores de quinasas hasta el análisis del impacto de mutaciones en quinasas.
Para los ensayos de fosfatasa, PhosphoSens® utiliza un enfoque similar con péptidos fosfo-Sox. Estos ensayos también son homogéneos, continuos y altamente sensibles, proporcionando datos confiables para el estudio de la actividad de fosfatasas bajo condiciones fisiológicas.
PhosphoSens® ofrece una solución sencilla pero poderosa para medir la actividad de quinasas y fosfatasas en diferentes contextos biológicos. Ya sea que esté investigando inhibidores de quinasas, analizando mutaciones de quinasas o estudiando la regulación de fosfatasas, PhosphoSens® proporciona resultados confiables, eficientes y precisos. Al simplificar estas mediciones complejas, PhosphoSens® ayuda a los investigadores a desentrañar los secretos de la señalización celular y allana el camino para el desarrollo de terapias dirigidas.
Referencias
Cheng, H.C., Qi, R.Z., Paudel, H. y Zhu, H.J., 2011. Regulación y función de las quinasas y fosfatasas. Enzyme research, 2011, p. 794089.
Shchemelinin, I., Sefc, L. y Necas, E., 2006. Las quinasas: su función y su importancia en el cáncer y otras enfermedades. Folia biologica, 52(3), p. 81.
Manning, G., Whyte, D.B., Martinez, R., Hunter, T. y Sudarsanam, S., 2002. El conjunto de quinasas del genoma humano. Science, 298(5600), p. 1912-1934.