Flow cytometry general protocol

I. Material necesario
Reactivos
- un anticuerpo primario, contra la molécula diana
- Un bloqueador del receptor Fc : " Anti-CD16/32, bloquea la unión Fc " que se une inespecíficamente a los anticuerpos primarios
- Un anticuerpo secundario en los casos de tinción indirecta con un anticuerpo primario no marcado
- Un isotipo de control no pertinente con una etiqueta similar a la del anticuerpo primario

Búferes
- Un tampón de tinción
- Un tampón de fijación intracelular
- Azul tripán para el recuento de células
- Líquido de vaina Gaines

Material
- Pipetas y Pipet-aid
- Centrifugadora
- Congelador
- Citómetro de flujo


II. Duración de la experimentación
- 30 mn preparación de muestras y diluciones de anticuerpos
- 30 mn a 1 h de incubación de anticuerpos
- 30 mn a 1 h de lectura de muestras con el citómetro de flujo (depende del número de muestras, la concentración de células y la capacidad del citómetro)
- TOTAL : 3 a 4 horas


III. Protocolo
- Diluir el anticuerpo primario y el isotipo de control en 50 µl de tampón de ensayo para respetar la concentración deseada optimizada tras la valoración de anticuerpos.
- Incubar 50 µl de preparación celular en 50 µl de preparación de anticuerpo o isotipo de control en una placa de 96 pocillos.
- Incubar durante 15-30 mn a 4°c en un cuarto oscuro

Nota : Es necesario optimizar el tiempo de incubación de los anticuerpos en función de su afinidad con el antígeno.

- Añadir 200 µl de tampón de ensayo para detener la reacción
- Centrifugar la célula en suspensión durante 5 mn (300 - 400g) a +4°c y desechar el sobrenadante
- Repetir dos veces los pasos de lavado con 200 µl de tampón de ensayo - Centrifugar la suspensión celular durante 5 min (300 - 400g) a 4°c

Opcional : Para la tinción indirecta, repetir el paso de tinción con anticuerpo secundario con el mismo protocolo y observaciones similares.
- Resuspender en 500 µl de tampón de ensayo o tampón de fijación suplementado con 2% de formaldehído.
- Lectura de células en un citómetro de flujo


IV. Motores de búsqueda
- Anticuerpos primarios
- Anticuerpos secundarios