Protocolo de citometría de flujo intracelular

I.Material necesario
Reactivos
- Un anticuerpo primario contra la molécula diana
- Un anticuerpo secundario en casos de tinción indirecta con un anticuerpo primario no marcado
- Un isotipo de control no pertinente con una etiqueta similar a la del anticuerpo primario

Amortiguadores
- Un tampón de tinción
- Un tampón de permeabilización
- Un tampón de fijación intracelular

Material
- Pipetas y Pipet-aid
- Centrifugadora
- Congelador
- Citómetro de flujo


II. Duración de la experimentación
- Estimulación celular (depende del tipo de célula)

- 2 a 3 horas de incubación de los anticuerpos
- 30 mn a 1 h de lectura de muestras con el citómetro de flujo (depende del número de muestras, la concentración de células y la capacidad del citómetro)
- TOTAL : 3 a 4 horas


III.Protocolo
- Prepare las células según su protocolo de adaptación celular
- Teñir las células según las recomendaciones del protocolo general para células en suspensión.
- Tras el primer lavado, fijar las células con 100 µl de tampón de fijación y agitar los tubos en vórtex.
- Incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente en una habitación oscura.
- Centrifugar durante 5 mn (300 - 400g) a 4°c
-  Añadir 1 ml de tampón de permeabilización
- Centrifugar durante 5 mn (300 - 400g) a 4°c
- Añadir 20 µl de anticuerpo primario diluido a una concentración óptima (según el fabricante) de 0,5 a 0,6 µg / 106 células) en tampón de permeabilización y agitar en vórtex.
- Incubar los tubos durante 20 minutos a temperatura ambiente.
- Añadir 1 ml de tampón de permeabilización
- Centrifugar durante 5 mn (300 - 400g) a 4°c
- Resuspender las células en 500 µl de tampón de ensayo o de fijación suplementado con formaldehído al 2
- Lectura de células en un citómetro de flujo


IV. Motores de búsqueda
- Anticuerpos primarios
- Anticuerpos secundarios