ELISA sin recubrimiento

I. Material necesario

Reactivos
- Un anticuerpo primario captura, específico de la molécula diana
- Un segundo anticuerpo primario de detección, específico de la molécula diana
- Una molécula recombinante para utilizar como patrón
- Soluciones de detección: por ejemplo, estreptavidina-HRP y TMB

Búferes
- Tampón de recubrimiento: por ejemplo PBS
- Tampón de bloqueo: p.ej. PBS con 5%BSA
- Tampón de lavado: por ejemplo PBS con 0.05%Tween
- Diluyente  para muestra y estándar: por ejemplo, PBS 1%BSA
- Solución de parada: por ejemplo, H2SO4 diluido.

Material - Placas de microtitulación de 96 pocillos
- Tapas/selladores de placas
- Pipetas graduadas de 5 ml y 10 ml
- Micropipetas monocanal ajustables de 20 µl a 1.000 µl con puntas desechables
- Micropipeta multicanal ajustable de 50 µl a 300 µl con puntas desechables
- Depósito de micropipeta multicanal
- Vasos de precipitados, matraces, cilindros necesarios para la preparación de reactivos
- Dispositivo de suministro de la solución de lavado (botella de lavado multicanal o sistema de lavado automático)
- Lector de placas de microtitulación capaz de leer a 450 nm



II. Periodo experimental
- 1 a 2h de etiquetado
- 3h de procedimiento
- 30 min de varios lavados
- 10 min de lectura
- TOTAL : 4 a 5 horas


III.Procedimiento
Recubrimiento - Diluir el anticuerpo de captura a la concentración adecuada (según el inserto) utilizando tampón de recubrimiento (se requiere un volumen final de 10 ml por placa).
- Añadir 100 µl de la solución de anticuerpo de captura a todos los pocillos de la placa, tapar e incubar toda la noche a 4°C.
- Aspirar el contenido de cada pocillo y, a continuación, lavar la placa al menos dos veces utilizando 400 µl de tampón de lavado en cada pocillo.

Nota : Tras el lavado final, asegúrese de eliminar todo el tampón restante secándolo suavemente con papel absorbente.

- Añadir 250 µl de solución de bloqueo a todos los pocillos de la placa, tapar e incubar a temperatura ambiente durante 2 horas.
- Aspirar el contenido de cada pocillo y lavar la placa al menos dos veces con 400 µl de tampón de lavado en cada pocillo.
Procedimiento de ensayo
- Añadir 100 µl de diluciones preparadas de patrón, muestra y control a los pocillos apropiados, cubrir la placa e incubar a temperatura ambiente durante 1 hora como mínimo.
- Aspirar el contenido de cada pocillo y, a continuación, lavar la placa al menos dos veces utilizando 400 µl de tampón de lavado en cada pocillo.

- Añadir 100 µl del anticuerpo de detección diluido (diluido según el inserto) a cada pocillo, cubrir la placa e incubar a temperatura ambiente durante 1 hora como mínimo.
- Aspirar el contenido de cada pocillo y, a continuación, lavar la placa al menos dos veces utilizando 400 µl de tampón de lavado en cada pocillo.
- Añadir 100 µl de la solución de estreptavidina-HRP a todos los pocillos, cubrir la placa e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
- Aspirar el contenido de cada pocillo y, a continuación, lavar la placa al menos dos veces utilizando 400 µl de tampón de lavado en cada pocillo.
- Añadir 100 µl de la solución de TMB a todos los pocillos, cubrir la placa e incubar a temperatura ambiente durante un mínimo de 10 minutos.
Nota : El tiempo de incubación de la solución de sustrato suele estar determinado por el rendimiento del lector de ELISA. Muchos lectores de ELISA sólo registran la absorbancia hasta 2,0 D.O. Por lo tanto, el analista debe observar el desarrollo del color en los micropocillos individuales y detener la reacción del sustrato antes de que los pocillos positivos dejen de estar dentro del intervalo registrable.
- Añadir 100 µl de solución de parada a todos los pocillos y, en 30 minutos, medir las lecturas de absorbancia a 450 nm (si se dispone de 620 nm como longitud de onda de referencia, se aceptan 610-650).