Los métodos tradicionales de cultivo celular en 2D someten a las células a un estado arquitectónico no fisiológico. Cuando se cultivan en 2D, las células de mamífero adoptan un estado bipolar con un lado basal y otro apical. Para abordar esta morfología antinatural, se produce una remodelación del citoesqueleto y la consiguiente ultraestructura de la célula se ve muy alterada (Ravi et al., 2015). Las células cultivadas en 2D también tienen acceso ilimitado al oxígeno, los nutrientes y los metabolitos, lo que no ocurre en sus respectivos tejidos in vivo. Estas limitaciones implican, en última instancia, que los laboratorios que realizan ensayos con células en este entorno antinatural obtienen resultados menos fiables in vitro.

El cultivo celular en 3D crea una arquitectura tridimensional para el crecimiento celular, ofreciendo un entorno más cercano y fisiológicamente relevante. El crecimiento de células en andamiajes tridimensionales favorece interacciones precisas entre células y entre células y el entorno extracelular, con un acceso variable al oxígeno, los nutrientes y los metabolitos. Las células de mamíferos que se asientan en un entorno más representativo, reflejo de su tejido huésped in vivo, muestran una expresión génica, una topología de empalme y unos biomarcadores más relevantes in vitro, lo que a su vez ofrece una fiabilidad mucho mayor en términos de modelización de fármacos y toxicidad en el laboratorio (Lv et al., 2016).

 

 

Diseño de andamios

Estudios recientes demuestran la importancia de los gradientes discretos de oxígeno en el movimiento celular a través de la interfaz del andamio (Ardakani et al, 2014). Las células cultivadas en estructuras de pila de madera suelen tener una distribución heterogénea, con agrupaciones comunes. Al introducir un gradiente de oxígeno discreto a través de la interfaz de nuestro andamio 3D PETG, fomentamos la proliferación celular desde el centro hacia la periferia. El resultado es un sistema mucho más equilibrado de células en el andamio, con patrones de confluencia similares a los del tejido in vivo.

Copner Biotech ha desarrollado un software de modelado 3D a medida y una técnica de impresión 3D de última generación para crear estas complejas arquitecturas. Nuestro proceso de fabricación aditiva demuestra una alta consistencia lote a lote, minimizando las variables en sus modelos celulares 3D.

 

Trabajo de validación de la microestructura del andamio - (Izquierda) Vista superior del andamio de PETG utilizando un microscopio óptico estándar. (Derecha) Sección transversal de un andamio de PETG obtenida mediante microscopía electrónica de barrido (SEM).

Protocolos de esterilización y siembra celular

Notas antes de empezar

• Antes de su uso, los andamiajes deben ser hidrofílicos mediante un lavado con etanol al 70 % durante 15 minutos. Tenga en cuenta que los andamiajes deben colocarse en la orientación correcta antes de su uso (véase la figura siguiente). Al lavar con etanol, asegúrese de pipetear bien la solución a través de los poros interconectados del andamio.
• Añada suficiente etanol para cubrir completamente el andamio, retírelo y lávelo 2 veces con el medio de cultivo adecuado (2 ml).
• Para evitar que se seque, deje el andamio en el último lavado con medio (2 ml) hasta que sea necesario.
• Recomendamos dejar los andamios en este medio final durante 4 horas para mejorar la posterior adhesión celular.

Orientación correcta del andamio - El andamio del extremo izquierdo representa la orientación correcta para su uso, mientras que los demás andamios están al revés. Tenga en cuenta que la base de los andamios puede variar de aspecto.

Siembra de células en el andamio

• Retire con una pipeta todo el medio de cultivo celular del pocillo antes de la siembra.
• Pipetee lentamente la densidad celular deseada mediante una solución de medio celular de 100ul en la parte superior del andamio, teniendo cuidado de asegurarse de que la solución impregne los poros interconectados tanto como sea posible.
• Vuelva a colocar los andamios sembrados en la incubadora durante 3 horas para permitir la fijación de las células.
• Tras las 3 horas de incubación, llene el pocillo restante con 1,4 ml de medio completo.
• Cambiar el medio de cultivo cada 2 días hasta el final del cultivo.
• Las células pueden recuperarse del andamio tras un tratamiento con tripsina 1X durante 15 minutos.
• Recomendamos utilizar inicialmente varias densidades celulares para optimizar el protocolo de cultivo antes de sus experimentos.
• La densidad celular recomendada oscila entre 150.000 y 500.000 células por andamio.

Fijación celular

Los andamios 3D PETG de Copner Biotech facilitan eficazmente la adhesión de células de mamíferos, utilizando al mismo tiempo bajas concentraciones de siembra celular. Las células utilizadas hasta la fecha incluyen, entre otras, fibroblastos L929, queratinocitos, células HeLa, células MCF-7, células A549 e iPSC.

Imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) de células L929 cultivadas en un andamio de PETG el séptimo día (50.000 células sembradas el primer día). Las células muestran una migración exitosa desde el centro hacia la periferia del andamio, creando un sistema celular equilibrado y confluente en el proceso.

Nuestro sistema operativo de impresión 3D a medida, junto con la tecnología de impresión de alta precisión, permite la creación de regiones específicas de andamiaje con una rugosidad superficial óptima. Estas regiones dan lugar a las primeras células que se adhieren con éxito desde el primer día de siembra y actúan como punto de partida para la proliferación celular y la migración a la periferia. La migración se ve estimulada por gradientes discretos de oxígeno y nutrientes a través de la interfaz del andamio, formados por la heterogeneidad en el tamaño y la distribución de los poros.

Viabilidad celular

Nuestro material PETG se ha modificado para optimizar la rugosidad de la superficie y mejorar así la adhesión y proliferación celular. Se ha confirmado que este material final inerte y no citotóxico es seguro para su uso en cultivos celulares, ya que no muestra efectos negativos sobre el crecimiento o la función de las células, lo que facilita la transición del cultivo celular 2D al 3D.

Los andamios 3D de PETG también presentan rigidez y no se degradan, lo que los hace muy adecuados para el cultivo de células a largo plazo.

Citotoxicidad (A) Liberación de LDH (n=3) observada por densidad óptica a 490 nm (B) Intensidad de fluorescencia relativa del ensayo alamarBlue (n=3). La línea celular L929 a una densidad de 1 x 104 células se cultivó con medios de control, medios acondicionados del día 1 o medios acondicionados del día 7 durante 24h a 37°C. La figura 13. muestra (A) la liberación de LDH (n=3) en cada condición de tratamiento según la densidad óptica a 490 nm (B) la intensidad de fluorescencia relativa del ensayo almarBlue (n=3) en cada condición de tratamiento. Significación estadística determinada por la prueba de Friedmans; * p < 0,05.

Proliferación celular

Nuestro material PETG media en los eventos de división celular, al tiempo que minimiza la pérdida de células, lo que resulta en una expansión significativa de los cultivos en un corto espacio de tiempo. Esto resulta especialmente útil para quienes desean estudiar células en la fase de crecimiento exponencial o investigar acontecimientos de división celular en tiempo real.

A continuación, las células L929 demostraron una capacidad notablemente mayor para formar puntos de adhesión focal alargados en andamios PETG 3D, en comparación con el cultivo 2D estándar. La adhesión focal a las diversas superficies del andamio es importante para el inicio de diversas señales, estimulando aún más la proliferación y diferenciación celular (Lee et al, 2004).

(Izquierda) Intensidad de fluorescencia relativa del ensayo alamarBlue (n=3) en los puntos temporales; día 1 y día
7. Significación estadística determinada por la prueba t pareada; * p < 0,05, ** p < 0,01. (Derecha) Puntos de adhesión focal alargados, que indican una morfología de fibroblasto sano en cultivo 3D.

Formación de esferoides

Cuando se utilizan altas concentraciones de siembra celular y se cultiva durante un periodo prolongado (7 días o más), los andamios 3D PETG favorecen la formación de cultivos esferoides. Los sistemas de cultivo en esferoides proporcionan un entorno fisicoquímico similar in vivo al facilitar las interacciones célula-célula y célula-matriz para superar las limitaciones de los cultivos tradicionales en 2D.

El sistema de andamiaje 3D PETG tiene poros interconectados en toda la estructura y está diseñado para cultivar y recolectar esferoides con facilidad. Utilizando el orificio central del andamio, los usuarios pueden aspirar y cosechar cultivos de esferoides pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una fuerza mínima. Este novedoso método de cultivo y recolección de esferoides permite a los usuarios crear modelos de esferoides en 3D fiables, sin necesidad de realizar múltiples pasos ni de introducir errores humanos en la manipulación de los esferoides.

 

Imágenes SEM de esferoides dérmicos cultivados en el andamio 3D PETG. Los fibroblastos y los queratinocitos se cultivaron durante 7 días, después de sembrarlos a una concentración de 100K el día 1. Los esferoides se extrajeron fácilmente de los andamiajes aspirándolos con una pipeta. Los esferoides se cosecharon fácilmente de los andamios mediante aspiración con pipeta y mostraron un daño reducido en comparación con los métodos de cosecha de los sistemas de hidrogel.

Formación de organoides

Además de la formación de esferoides, cuando se utilizan junto con los factores de crecimiento adecuados, los andamiajes 3D pueden emplearse para generar cuerpos embrioides tempranos y, posteriormente, organoides. Los andamiajes pueden utilizarse en el cultivo a largo plazo de organoides, gracias a su estructura robusta y a su resistencia.

Figura - Las primeras estructuras de cuerpos embrioides (imagen superior izquierda) pueden extraerse con una pipeta de la estructura de andamiaje y seguir cultivándose para formar estructuras organoides más grandes y complejas (imagen superior derecha) en placas de baja fijación. Las estructuras celulares pueden teñirse y visualizarse mediante microscopía durante y después del cultivo (imagen inferior derecha).

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