Protocol revelation amplified : DBS Range

I. Material necesario

Reactivos

- Anticuerpo primario
- Diluyente del anticuerpo primario
- Solución de prebloqueo
- Medio de montaje

Búferes
- Tampón de lavado inmunológico
- Xileno o reactivos desparafinantes
- Etanol absoluto
- Agua destilada o desionizada



II. Duración de la experimentación
- 10 mn de bloqueo
- 30-60 mn de incubación de las secciones en el anticuerpo primario
- 36 o 31 mn de incubación de otros
- 20 mn de pasos de aclarado

-TOTAL : 1h31 a 2h06
III. Procedimiento de tinción

1. Bloque de peroxidasa. Incube los portaobjetos en el bloque de peroxidasa durante 5 minutos.
Enjuague los portaobjetos 3 x 1 minutos con tampón de lavado Immuno.
2. Bloqueo previo (opcional). Añadir 2 gotas (100 µL) o un volumen suficiente de solución de prebloqueo para cubrir la sección de tejido (10 minutos).
Escurrir o secar la solución. No aclarar.
3. Anticuerpo primario Incubar con el Anticuerpo Primario durante 30 - 60 minutos, preparado según el protocolo recomendado por el fabricante a la concentración deseada. Los anticuerpos primarios concentrados pueden diluirse con el diluyente de anticuerpos primarios.
Lavar los portaobjetos 3 x 1 minutos en tampón de lavado Immuno.
4. Potenciador de la penetración de polímeros.  Aplicar el potenciador de penetración de polímeros e incubar durante 10 minutos.
Enjuague los portaobjetos 3 x 1 minutos con tampón de lavado Immuno.
5. Etiqueta PolyVue. Incubar el tejido con reactivo PolyVue HRP Label durante 10 minutos.

Lavar los portaobjetos 3 x 1 minutos con Immuno Wash Buffer.
6. DAB/Plus estable. Preparar la solución de trabajo de sustrato Stable DAB/Plus (ver arriba).
Incubar el tejido durante 5-10 minutos con la solución preparada de sustrato estable DAB/Plus. Controlar el nivel de tinción para determinar el tiempo óptimo de incubación.
Enjuague los portaobjetos 3 x 1 minutos con agua.

7. Contramanchas. Incubar el tejido durante 1 minuto con una tinción de contraste (por ejemplo, hematoxilina).
Lavar los portaobjetos 3 x 1 minutos en agua, seguido de 1 x 1 minuto en Immuno Wash Buffer, luego 1 x 1 minuto en agua.
8. Deshidratación y recubrimiento. Deshidratar los tejidos mediante series graduadas de etanol, seguidas de series de xileno.Aplicar cubreobjetos con medio de montaje permanente.


IV.Motor de búsqueda
- Anticuerpo primario