ELISA pre-rivestito

Kit ELISA
I. Materiale richiesto

Reagenti
- Un anticorpo primario di rilevamento, specifico per la molecola bersaglio
- Una molecola ricombinante da usare come standard
- Soluzioni di rivelazione: ad es. streptavidina-HRP e TMB
Buffer
- Tampone di blocco: ad es. PBS con 5%BSA
- Tampone di lavaggio: ad es. PBS con 0,05%Tween
- Diluente per il campione e lo standard: ad es. PBS 1%BSA
- Soluzione di arresto: ad esempio H2SO4 diluito.

Materiale - Piastre da microtitolazione da 96 pozzetti pre-rivestite con anticorpo di cattura
- Copripiastre/sigillatori
- Pipette graduate da 5 ml e 10 ml
- Micropipette monocanale regolabili da 20 µl a 1.000 µl con puntali monouso
- Micropipetta multicanale regolabile da 50 µl a 300 µl con puntali monouso
- Serbatoio per micropipette multicanale
- Becher, matracci, cilindri necessari per la preparazione dei reagenti.
- Dispositivo per l'erogazione della soluzione di lavaggio (flacone di lavaggio multicanale o sistema di lavaggio automatico)
- Lettore di micropiastre in grado di leggere a 450 nm



II. Periodo sperimentale
- 3 ore di procedura
- 30 minuti di vari lavaggi
- 10 minuti di lettura
- TOTALE : 4 ore


III. Procedura
- Aggiungere 100 µl delle diluizioni standard, campione e controllo preparate nei pozzetti appropriati, coprire la piastra e incubare a temperatura ambiente per almeno 1 ora
- Aspirare il contenuto di ciascun pozzetto, quindi lavare la piastra almeno due volte utilizzando 400 µl di tampone di lavaggio in ciascun pozzetto.
- Aggiungere 100 µl di anticorpo di rilevazione diluito (come da inserto) in ogni pozzetto, coprire la piastra e incubare a temperatura ambiente per almeno 1 ora.
- Aspirare il contenuto di ciascun pozzetto, quindi lavare la piastra almeno due volte utilizzando 400 µl di tampone di lavaggio in ciascun pozzetto.
- Aggiungere 100 µl di soluzione di streptavidina-HRP in tutti i pozzetti, coprire la piastra e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
- Aspirare il contenuto di ciascun pozzetto, quindi lavare la piastra almeno due volte utilizzando 400 µl di tampone di lavaggio in ciascun pozzetto.
- Aggiungere 100 µl di soluzione di TMB in tutti i pozzetti, coprire la piastra e incubare a temperatura ambiente per almeno 10 minuti.
Nota:il tempo di incubazione della soluzione di substrato è solitamente determinato dalle prestazioni del lettore ELISA. Molti lettori ELISA registrano l'assorbanza solo fino a 2,0 O.D. Pertanto, lo sviluppo del colore all'interno dei singoli micropozzetti deve essere osservato dall'analista e la reazione del substrato deve essere interrotta prima che i pozzetti positivi non rientrino più nell'intervallo registrabile.
- Add 100 µl of stop solution to all wells and within 30mins measure the absorbance readings at 450nm (when available with 620nm as the reference wavelength, 610-650 is acceptable)