Immunoistochimica (IHC) Protocollo generale

I. Materiale richiesto
Reagenti
- Un anticorpo primario , marcato o meno, contro la molecola bersaglio
- Kit rivelazione
- Cromogeno

Buffer
- Xilene
- Bagni alcoolici al 70%, 80% e 95%
- Perossido di idrogeno (H2O2)
- Tris EDTA, Tris HCl
- Tween-20

Materiale
- Pipette e Pipet-aid
- Bagno d'acqua


II. Durata della sperimentazione
- 10 mn di blocco della perossidasi
- 30 mn di recupero antigenico
- 1 ora di incubazione dell'anticorpo primario
- 10 mn di incubazione del cromogeno
- 2 h di fasi di risciacquo e bagni
- TOTALE : 4 ore


III. Protocollo
- Deparaffinare la sezione in 3 cambi di xilene, per 5 minuti ciascuno.
- Lavare la sezione in alcol 96%, 80% e 70%benzilico per 5 minuti ciascuno.
- Risciacquare con acqua distillata.
- Bloccare la perossidasi endogena incubando il tessuto in perossido di idrogeno (H2O2) al 3% per 10 minuti.
- Lavare in acqua distillata per 5 minuti.
- Lavare in tampone Tris-HCl 0,05 M, pH 7,6, integrato con lo 0,2% di Tween-20 (tampone A) per 5 minuti.
- Per prodotti concentrati: Incubare la sezione con l'anticorpo primario diluito nel tampone A alla diluizione 1:100 - 200 per 1 ora nella camera umida chiusa.
Per i prodotti RTU: Incubare la sezione con l'anticorpo primario (pronto all'uso) per 1 ora in una camera umida chiusa.
 - Lavare due volte per 5 minuti con il tampone A.

- Applicare l'anticorpo secondario (il protocollo dipende dal fornitore) e procedere al protocollo standard di immunoistochimica (HRP - Perossido - DAB).
- Lavare due volte per 5 minuti con il tampone A.
- Applicare il cromogeno (DAB), 10 minuti.
- Lavare in acqua per 10 minuti.
- Colorare in ematossilina per 5 minuti.
- Lavare in acqua per 10 minuti.
- Disidratare la sezione in 2 cambi di alcool benzilico al 96% per 5 minuti ciascuno.
- Lavare la sezione in 2 cambi di xilene per 2 minuti ciascuno.
- Montare il vetrino per l'osservazione.