Protocollo di immunoistochimica - Metodo Avidina/Biotina (ABC)
Il principio dei kit di rilevazione ABC si basa sull'affinità dell'avidina (o della streptavidina) per la biotina. L'abbreviazione ABC sta infatti per Complesso Avidina/Biotina.
In generale, i kit di rilevamento ABC sono composti da:
- Un anticorpo secondario biotinilato
- Complesso avidina/enzima
I kit possono contenere o meno i tamponi di blocco e di diluizione e il substrato, a seconda dei formati.
I. Materiale richiesto
Reagenti
- Un anticorpo primario , marcato o meno, contro la molecola bersaglio
- Kit rivelazione
- Cromogeno
Buffer
- Xilene
- Bagni alcoolici al 70%, 80% e 95%.
- Perossido di idrogeno (H2O2)
- Tris EDTA, Tris HCl
- Tween-20
Reagenti
- Un anticorpo primario , marcato o meno, contro la molecola bersaglio
- Kit rivelazione
- Cromogeno
Buffer
- Xilene
- Bagni alcoolici al 70%, 80% e 95%.
- Perossido di idrogeno (H2O2)
- Tris EDTA, Tris HCl
- Tween-20
II. Tempo di sperimentazione
- 10 min per il blocco della perossidasi
- 30 minuti per il recupero dell'antigene (se necessario)
- 30-60 min per l'incubazione con l'anticorpo primario
- 10 min per l'inubazione con l'anticorpo secondario biotinilato
- 10 min per l'incubazione con il coniugato di streptvidina perossidasi
- 5 min per il cromogeno
- 5 min per il cromogeno
- Colorazione con ematossilina (opzionale)
- TOTALE : 2-3 ore
- TOTALE : 2-3 ore
III. Protocollo
- Blocco della perossidasi: applicare 2 gocce (100 µl) o un volume sufficiente di reagente di blocco della perossidasi (soluzione al 3% di H2O2) per coprire la sezione di tessuto e incubare. Sciacquare il vetrino con acqua distillata.
- Pretrattamento HIER (fare riferimento alla scheda tecnica dell'anticorpo): Per l'anticorpo primario suggerito dal fornitore, potrebbe essere necessario un pre-trattamento HIER (Heat Induced Epitope Retrieval). Lavare con PBS 2 minuti, 3 volte.
- Pre-blocco: aggiungere 2 gocce o un volume di soluzione pre-bloccante sufficiente a coprire completamente la sezione di tessuto e incubare. Togliere la soluzione, senza risciacquare.
- Anticorpo primario (fornito dall'utente) : Applicare 2 gocce o un volume di anticorpo primario sufficiente a coprire completamente la sezione di tessuto. Incubare in camera umida per 30-60 minuti..
- Anticorpo secondario: applicare 2 gocce o un volume di anticorpo primario sufficiente a coprire completamente la sezione di tessuto. Incubare per 10 minuti.
-HRP-Streptavidina: applicare 2 gocce o un volume sufficiente di HRP-Streptavidina per coprire completamente la sezione di tessuto e incubare 10 minuti. Sciacquare con PBS per 2 minuti, 3 volte.
- Cromogeno: aggiungere 1 goccia o 2 gocce (per una maggiore sensibilità e contrasto) di cromogeno concentrato a 1 ml di substrato. Mescolare bene, proteggere dalla luce e utilizzare entro 5 ore. Applicare 2 gocce (100 µl) o un volume di cromogeno premiscelato sufficiente a coprire completamente il tessuto e incubare 5 minuti. Sciacquare con acqua distillata per 2 minuti, 3 volte.
- - Ematossilina (opzionale) : Controcolorare con 2 gocce (100 µl) o più gocce per coprire completamente il tessuto e attendere circa 10-20 sec. Sciacquare accuratamente con acqua corrente per 1-2 minuti. Immergere i vetrini in PBS fino a quando non mostrano un colore blu (circa 30-60 sec). Sciacquare bene in acqua distillata.
- Montaggio: Seguire la procedura di montaggio indicata nella scheda tecnica del produttore.
Note :
- La fissazione, lo spessore del vetrino, il recupero dell'antigene, la diluizione primaria e il tempo di incubazione influiscono significativamente sui risultati. Lo sperimentatore deve considerare tutti i fattori e determinare le condizioni ottimali quando interpreta i risultati.
- La colorazione dei tessuti dipende dalla loro corretta manipolazione e lavorazione prima della colorazione. Una preparazione impropria dei tessuti può portare a risultati falsi negativi o inconsistenti.
- Non mescolare reagenti di lotti diversi.
- Non lasciare asciugare i vetrini durante la colorazione.