ELISA non rivestito

I. Materiale richiesto

Reagenti
- Una cattura anticorpo primario specifica per la molecola bersaglio
- Una seconda rilevazione anticorpo primario specifica per la molecola bersaglio
- Una molecola ricombinante da usare come standard
- Soluzioni di rivelazione: ad es Streptavidina -HRP e TMB

Buffer
- Tampone di rivestimento: ad es. PBS
- Tampone di blocco: ad es. PBS con 5%BSA
- Tampone di lavaggio: ad es. PBS con 0.05%Tween
- Diluente  peril campione e lo standard: ad es. PBS 1%BSA
- soluzione superiore: ad es. H2SO4 diluito

Materiale - Piastre da 96 pozzetti per microtitolazione
- Copripiastre/sigillatori
- Pipette graduate da 5 ml e 10 ml
- Micropipette monocanale regolabili da 20 µl a 1.000 µl con puntali monouso
- Micropipetta multicanale regolabile da 50 µl a 300 µl con puntali monouso
- Serbatoio per micropipetta multicanale
- Becher, matracci, cilindri necessari per la preparazione dei reagenti
- Dispositivo per l'erogazione della soluzione di lavaggio (flacone di lavaggio multicanale o sistema di lavaggio automatico)
- Lettore di micropiastre in grado di leggere a 450 nm



II. Periodo sperimentale
- Da 1 a 2 ore di etichettatura
- 3 ore di procedura
- 30 minuti di vari lavaggi
- 10 minuti di lettura
- TOTALE: da 4 a 5 ore


III. Procedura
Rivestimento - Diluire l'anticorpo di cattura alla concentrazione appropriata (come da inserto) utilizzando il tampone di rivestimento (è necessario un volume finale di 10 ml per piastra).
- Aggiungere 100 µl di soluzione di anticorpo di cattura in tutti i pozzetti della piastra, coprire e incubare per una notte a 4°C.
- Aspirare il contenuto di ciascun pozzetto, quindi lavare la piastra almeno due volte utilizzando 400 µl di tampone di lavaggio in ciascun pozzetto.

Nota : Dopo il lavaggio finale, assicurarsi che tutto il tampone rimanente venga rimosso con un leggero tamponamento su carta assorbente.

- Aggiungere 250 µl di soluzione bloccante in tutti i pozzetti della piastra, coprire e incubare a temperatura ambiente per 2 ore.
- Aspirare il contenuto di ciascun pozzetto, quindi lavare la piastra almeno due volte utilizzando 400 µl di tampone di lavaggio in ciascun pozzetto; la piastra è ora pronta per l'esecuzione del test.
Procedura di analisi
- Aggiungere 100 µl delle diluizioni standard, campione e controllo preparate nei pozzetti appropriati, coprire la piastra e incubare a temperatura ambiente per almeno 1 ora.
- Aspirare il contenuto di ciascun pozzetto, quindi lavare la piastra almeno due volte utilizzando 400 µl di tampone di lavaggio in ciascun pozzetto.
- Aggiungere 100 µl di anticorpo di rilevazione diluito (come da inserto) in ogni pozzetto, coprire la piastra e incubare a temperatura ambiente per almeno 1 ora.
- Aspirare il contenuto di ciascun pozzetto, quindi lavare la piastra almeno due volte utilizzando 400 µl di tampone di lavaggio in ciascun pozzetto.
- Aggiungere 100 µl di soluzione di streptavidina-HRP in tutti i pozzetti, coprire la piastra e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
- Aspirare il contenuto di ciascun pozzetto, quindi lavare la piastra almeno due volte utilizzando 400 µl di tampone di lavaggio in ciascun pozzetto.
- Aggiungere 100 µl di soluzione di TMB in tutti i pozzetti, coprire la piastra e incubare a temperatura ambiente per almeno 10 minuti.
Nota : Il tempo di incubazione della soluzione di substrato è solitamente determinato dalle prestazioni del lettore ELISA. Molti lettori ELISA registrano l'assorbanza solo fino a 2,0 O.D. Pertanto, lo sviluppo del colore all'interno dei singoli micropozzetti deve essere osservato dall'analista e la reazione del substrato deve essere interrotta prima che i pozzetti positivi non rientrino più nell'intervallo registrabile.
- Aggiungere 100 µl di soluzione di stop a tutti i pozzetti ed entro 30 minuti misurare le letture di assorbanza a 450 nm (se disponibile con 620 nm come lunghezza d'onda di riferimento, 610-650 è accettabile).