Reagenti e strumenti per immunologia, biologia cellulare e biologia molecolare
 
> Technical resources > Protocols > Western Blot > Protocollo per il Western blot

Protocollo per il Western blot

Protocollo per il Western blot

 

Prodotti necessari:
 
Proteins preparation and separation by gel electrophoresis
  1. Rimuovere un piccolo volume di campione di proteine per determinare la concentrazione di proteine
  2. Prendi 20 µg di proteine e aggiungi Laemmli
  3. Far bollire 5 minuti a 95°C, quindi far girare i tubi
  4. Caricare uguale volume di proteine nei pozzetti del gel SDS-PAGE (acrilammide%dipende dalla dimensione della proteina bersaglio), non dimenticare un pozzo per il controllo scale di peso.
  5. Migrazione ad amperaggio costante con buffer appropriato

Trasferimento di proteine dal gel alla membrana
  1. Posizionare il sandwich (gel / membrana / carta assorbente) nella scatola di trasferimento e assicurarsi che non ci siano bolle d'aria intrappolate
  2. Trasferimento a tensione costante con il buffer appropriato


Incubazione e rivelazione di anticorpi
  1. Macchia la membrana con Ponceau red per verificare la qualità del trasferimento delle proteine
  2. Risciacquare la membrana e incubare in soluzione di blocco
  3. Incubare durante la notte con l'anticorpo primario a 4°C
  4. Risciacquare la macchia
  5. Incubare con l'anticorpo secondario 1h a temperatura ambiente
  6. Risciacquare la membrana
  7. Applicare il substrato alla macchia