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Saggi basati su reporter
I saggi basati su reporter sono saggi biologici utilizzati per misurare la capacità di regolazione di una sequenza di DNA sconosciuta, studiare la regolazione genica da parte di fattori ad azione cis- o trans- o misurare l'attivazione di vie di segnalazione cellulare.
In questi saggi, la sequenza promotrice sconosciuta è collegata a un gene reporter facilmente rilevabile il cui prodotto può essere facilmente individuato e misurato in modo quantificabile. I livelli di espressione del gene reporter sono monitorati attraverso la quantificazione dell'attività enzimatica della proteina reporter, che viene utilizzata per caratterizzare le sequenze regolatorie, l'attività dei fattori di trascrizione, la segnalazione cellulare o le vie di segnalazione.
I geni reporter più comuni sono la beta-galattosidasi, la luciferasi, la beta-lattamasi, la fosfatasi alcalina e la GFP (proteina a fluorescenza verde).
Le luciferasi sono utilizzate per creare saggi reporter bioluminescenti che sono altamente quantitativi, sensibili in un ampio intervallo dinamico e facilmente rilevabili misurando la luce emessa.
La maggior parte dei saggi con geni reporter prevede un gene reporter o due, con il secondo reporter espresso da un vettore "di controllo" per normalizzare i risultati del reporter sperimentale.
Il gene reporter di controllo è in genere guidato da un promotore costitutivo e il vettore di controllo viene cotrasfettato con il reporter sperimentale.
Le cellule sono esposte a diversi fattori o condizioni, il cui effetto può essere facilmente monitorato misurando le variazioni dell'emissione luminosa. Per misurare la proteina del gene reporter espressa si utilizzano vari metodi di rilevazione, come la luminescenza, l'assorbanza e la fluorescenza.
I saggi reporter possono essere utilizzati anche per valutare quantitativamente l'attività di RNAi e identificare i modulatori di RNAi. Possono anche essere utilizzati per lo screening di sostanze chimiche che interrompono la segnalazione degli androgeni.
Le cellule reporter utilizzano la trasfezione transitoria per garantire risultati affidabili e precisi e sono ottimizzate per fornire le migliori condizioni sperimentali con i reagenti forniti nei kit, consentendo una facile standardizzazione degli esperimenti.
I kit di saggio basati su cellule reporter offrono una sensibilità e un range dinamico ottimali per la quantificazione dell'attività recettoriale, rendendoli un servizio di screening affidabile ed economico per composti farmaceutici, sostanze chimiche o campioni ambientali.
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