Produzione potenziata di plasmidi: Ottenere un aumento di 21 volte dei plasmidi

Introduzione 

La domanda di DNA plasmidico (pDNA) è aumentata negli ultimi anni a causa dell'elevata richiesta di terapie geniche e vaccinazioni a base di DNA (il pDNA è comunemente utilizzato per la sua elevata sicurezza). Pertanto, è molto richiesta una maggiore produzione di pDNA con un sistema di purificazione e di controllo della qualità economico, riproducibile e affidabile. I plasmidi sono tipicamente prodotti in cellule di Escherichia coli (E. coli) e successivamente isolati attraverso una serie di passaggi di purificazione. Sebbene l'E. coli produca principalmente l'isoforma più compatta di DNA plasmidico (pDNA) superavvolto (SC), di solito sono presenti anche isoforme di pDNA circolare aperto (OC), intaccato, lineare e denaturato. La presenza di diverse isoforme può essere causata da cambiamenti conformazionali che si verificano nell'ospite batterico e durante la lavorazione della biomassa (ad esempio la lisi cellulare) e le fasi di purificazione del plasmide [1]. Diverse linee di evidenza indicano che alti livelli di SC sono necessari per suscitare una risposta immunitaria efficace e, in ultima analisi, una protezione dalle infezioni [2,3]. Inoltre, l'isoforma SC del pDNA è quella desiderata per la trasfezione, in quanto consente una maggiore efficienza di trasfezione grazie al suo impacchettamento più compatto rispetto alle varianti OC o lineari [4-6].

La cromatografia a scambio anionico (AEC) è un metodo comune per purificare il pDNA SC da altre isoforme plasmidiche e per rimuovere le impurità presenti derivanti dall'organismo ospite. Idealmente, il processo di produzione a monte fornisce già prevalentemente pDNA SC di alta qualità. 

Materiali e metodi 

Trasformazione e coltivazione

Il plasmide pCMV3-GFP (6883 bp) contenente un gene di resistenza all'ampicillina (Sino Biological) è stato trasformato in cellule di E. coli NEB 5-alfa competenti (New England Biolabs) secondo il protocollo del produttore. La miscela di trasformazione è stata piastrata su una piastra di selezione (LB agar con 100 µg/mL di ampicillina) e incubata per una notte a 37°C. Una singola colonia è stata scelta dalla piastra di selezione e una coltura notturna è stata preparata in una beuta da 500 mL in vetro non soffiato contenente 50 mL di terreno LB (triptone 10 g/L, estratto di lievito 5 g/L, NaCl 10 g/L, pH 7,0 ±0,2) con 100 µg/mL di ampicillina. La fiasca è stata sigillata con un foglio di alluminio ed è stata incubata a 37°C e 180 min -1 in un incubatore orbitale con tappetini adesivi Sticky Stuff (INFORS HT Multitron Incubator Shaker, 25 mm shaking throw) per tutta la notte (almeno 18 ore). Per la coltura principale, sono state preparate tre triple di beute di vetro da 250 mL non soffocate contenenti 25 mL di LB con 100 µg/mL di ampicillina, che è considerato un progetto di coltivazione standard.

Sono state preparate tre triple di fiasche Ultra Yield® da 250 mL (Thomson, P/N: 931144) contenenti 100 mL di terreno Plasmid+® (Thomson, P/N: 446300) con 100 µg/mL di ampicillina e lo 0,02% di Antifoam 204 (Sigma-Aldrich). Sia il sistema di coltivazione standard che quello di Thomson sono stati inoculati dalla coltura notturna, con una OD600nm iniziale di 0,2. Le beute Ultra Yield® sono state sigillate con l'AirOtop® Enhanced Seal (Thomson, P/N: 899423) e le beute con un foglio di alluminio. Le beute sono state incubate a 37°C a 350 min -1 o 180 min -1 nell'agitatore INFORS HT Multitron (lancio di agitazione da 25 mm) con pinze per beute. Si noti che i tappetini adesivi Sticky Stuff non sono adatti per 350 min -1 e l'uso di pinze è obbligatorio. Le colture sono state coltivate per almeno 24 ore e i campioni sono stati prelevati a intervalli regolari per misurare l'OD600nm nel tempo.

Purificazione del DNA

Per la purificazione del plasmide è stato utilizzato il PureYield™ Plasmid Miniprep System (Promega). La sospensione cellulare LB è stata utilizzata non diluita, mentre le sospensioni cellulari Thomson sono state diluite 9 volte per corrispondere approssimativamente al valore di OD dei campioni LB. Sono stati prelevati 600 µL di ogni sospensione cellulare che è stata poi centrifugata e il pellet è stato risospeso in 600 µL di acqua priva di nucleasi. Tutte le altre fasi successive sono state eseguite in conformità al protocollo rapido FB093 del PureYield™ Plasmid Miniprep System per i kit A1223 o A1222. La purificazione del DNA è stata eseguita con il metodo della centrifugazione. I plasmidi sono stati eluiti con acqua priva di nucleasi fornita con il kit. La concentrazione e la purezza del DNA dei campioni eluiti sono state misurate a 230, 260 e 280 nm con uno spettrofotometro NanoDrop™ 2000/2000c (Thermo Fisher Scientific).

Analisi dei plasmidi mediante HPLC

Per l'analisi dei plasmidi è stato utilizzato un HPLC serie 1100 (Agilent) con rivelatore DAD serie 1100 (Agilent, G1315B) a 260 nm. I campioni sono stati misurati su una colonna BioPro IEX QF, 100 x 4,6 mm, granulometria 5 µm (YMC, QF00S05-1046WP). 5 µL di ciascun campione sono stati iniettati e misurati in triplo. La temperatura della colonna è stata impostata a 35°C. La fase mobile A (20 mM Tris-HCl, pH 7,4) e la fase mobile B (20 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, pH 7,4) sono state utilizzate per eluire il campione in un metodo a gradiente con un flusso costante di 0,5 mL/min. Il gradiente è stato eseguito dal minuto 0 al minuto 0,7 con la fase mobile A (MPA) al 25% e la fase mobile B (MPB) al 75%. A partire dal minuto 0,7 il gradiente è stato applicato e la composizione dal 75% di MPB è stata modificata al 100% durante 20 minuti fino al minuto 20,7 ed è stata mantenuta al 100% fino al minuto 24. Al minuto 24,01 la composizione è stata modificata al 25% di MPA e al 75% di MPB fino al minuto 30 (fine dell'iniezione).

La crescita batterica in beute con terreno LB (coltura standard) a 350 min-1 e in beute Ultra Yield® con terreno Plasmid+® a 350 min -1 ha mostrato modelli simili fino a 4 ore di coltura, come illustrato nella Figura 1. Per la coltura a 180 min -1, le somiglianze sono state riscontrate anche per la coltura a 180 minuti. Per la coltivazione a 180 min -1, le somiglianze sono state osservate fino a 8 ore. Nel caso della crescita batterica in fiasche Ultra Yield® , il tasso di crescita iniziale è leggermente più lento durante le prime ore rispetto alla coltivazione standard.

Tuttavia, un netto contrasto tra le due condizioni di coltivazione diventa evidente dopo 4 ore (350 min -1) e 8 ore (180 min -1). Per l'approccio di coltivazione standard, la densità ottica si riduce rispetto alla misurazione a 12 ore, indicando che il numero di cellule vitali sta già diminuendo a questo punto. Al termine del periodo di coltivazione, i valori di OD del sistema Ultra Yield® mantenuti a 180 min-1 e 350 min-1 superavano quelli del sistema di coltivazione standard rispettivamente di oltre 2 volte e 7 volte.

 

Dopo la purificazione del plasmide, la resa plasmidica totale per la condizione 180 min -1 è stata più di 5 volte superiore per ogni fiasca Thomson rispetto alle fiasche Erlenmeyer (Figura 2a). Tenendo conto della differenza di volume tra le fiasche, la resa plasmidica è stata di 1,4 volte superiore con il sistema di coltivazione Thomson rispetto al sistema di coltivazione standard. La proporzione di plasmide superavvolto rispetto a quello aperto (Figura 2b) era simile tra il sistema di coltivazione Thomson (67,7% di superavvolto) e il sistema di coltivazione standard (64,7% di superavvolto).

La differenza tra il sistema di coltura Thomson e il sistema di coltura standard è più pronunciata quando viene mantenuto a 350 min -1. In questo caso, la quantità totale di plasmodi supercoilati aperti è stata pari al 67,7%. In questo caso, la quantità totale di plasmide purificato per fiasca è circa 21 volte superiore con il sistema Ultra Yield® di Thomson rispetto alla condizione di coltivazione standard, o circa 5 volte superiore se si tiene conto della differenza di volume (Figura 3a). La proporzione di plasmide superavvolto rispetto a quello aperto (Figura 3b) è risultata ancora una volta simile tra il sistema di coltivazione Thomson (88,5% superavvolto) e il sistema di coltivazione standard (88,9% superavvolto).

Conclusione 

I dati dimostrano che le comuni velocità di agitazione di 180 min -1 (orbita di 25 mm) non sono sufficienti a sostenere una crescita cellulare ottimale nelle fiasche Thomson Ultra Yield®. Un'elevata velocità di agitazione di 350 min -1 fornisce un aumento di 3 volte della resa di biomassa, rispetto a 180 min -1. Con una migliore crescita cellulare, si è ottenuta una maggiore produzione di pDNA. Il successo di questa applicazione dipende in larga misura dal mantenimento di un'elevata velocità di agitazione per ottenere una miscelazione e un trasferimento di gas efficaci, che portino a rese più elevate. Quando la velocità di agitazione aumenta da 180 min -1 a 350 min -1, l'energia cinetica necessaria per agitare efficacemente la superficie aumenta di 4 volte. È fondamentale che il limite di carico dell'agitatore sia in grado di accogliere in modo sicuro le beute ad alta velocità. L'incubatore Shaker HT Multitron di INFORS può contenere 45 matracci da 250 mL, con una massa di terreno e coltura pari a 4,5 kg. Considerando la massa aggiuntiva del vassoio e dei morsetti per le beute, il limite di carico minimo dello shaker dovrebbe superare i 12 chilogrammi. Con le beute più grandi, è possibile caricare più di 10 L di terreno di coltura nello shaker, rendendo il limite di carico fisico e le dimensioni interne dello shaker estremamente importanti. Tutti questi fattori sottolineano la necessità di un agitatore robusto, come il Multitron Incubator Shaker, per sfruttare appieno i vantaggi di questo processo.

La combinazione delle beute Ultra Yield® con il terreno arricchito Plasmid+® e la tenuta potenziata AirOtop® ha portato a densità cellulari più elevate e a una quantità di plasmidi 21 volte superiore rispetto alle beute con terreno LB. La maggiore resa complessiva di plasmidi si traduce anche in una maggiore quantità di isoforma plasmidica supercoiled (SC), desiderata per la trasfezione di cellule di mammifero [4,5]. Considerando il costo totale di proprietà di un processo di produzione di plasmidi in laboratorio, l'uso delle fiasche Thomson Ultra Yield® , del terreno Plasmid+® in combinazione con un potente agitatore a 350 min -1 è meno costoso in mg/L di plasmidi rispetto alla coltivazione LB in Erlenmeyer di vetro. Investire in un buon agitatore per raggiungere velocità più elevate e nel sistema Thomson è vantaggioso.

Utilizzare il tappo a vite AIROTOP® Seal/Vented Media mL/Flask Velocità dell'agitatore (RPM)

Codice	Descrizione	Utilizzare la guarnizione/il tappo a vite ventilato di AIROTOP®.	Media mL/flacone	Velocità dell'agitatore (RPM)
931147	Palloni Ultra Yield® da 125 ml 50/CS - Sterile	899421 / 899109	35-50 mL/Flask	300-350
931144	Flaconi Ultra Yield® da 250 ml 50/CS - Sterile	899423 / 899110	75-100 mL/Flask	300-350
931141	Flaconi Ultra Yield® da 500 ml 25/CS - Sterile	899424 / 899111	150-200 mL/Flask	300-350
931138	Bottiglie da 1,5 l Ultra Yield® 12/CS - sterili	899425 / 899566	300 mL/Flask	300-350
931136-B	2.5L Ultra Yield® Flasks 6/CS - Sterile	899425 / 899566	500 mL/Flask	300-400
446300	Terreno arricchito Plasmid+® - Sterile	N/A	N/A	N/A

 

Riferimenti

1. D.M. Prazeres, T. Schluep, C. Cooney, Purificazione preparativa di DNA plasmidico superavvolto mediante cromatografia a scambio di anioni, J. Chromatogr. A 806 (1998) 31–45. https://doi.org/10.1016/s0021-9673(97)01254-5.
2. Lionel Cupillard, Véronique Juillard, Sophie Latour, Guy Colombet, N. Cachet, S. Richard, S. Blanchard, Laurent Fischer, Impatto del superavvolgimento plasmidico sull'efficacia di un vaccino a DNA antirabbico per la protezione dei gatti, Vaccine 23 (2005) 1910–1916. https://doi.org/10.1016/J.VACCINE.2004.10.018.
3. 3. Huangjin Li, Huaben Bo, Jinquan Wang, Hongwei Shao, Shulin Huang, Separazione delle forme circolari superavvolte da quelle aperte del DNA plasmidico e rilevamento dell'attività biologica, Cytotechnology 63 (2011) 7–12. https://doi. org/10.1007/s10616-010-9322.
4. Christof Maucksch, Alexander Bohla, Florian Hoffmann, Martin Schleef, Manish Kumar Aneja, Markus Elfinger, Dominik Hartl, Carsten Rudolph, Espressione transgenica di concatenamenti di DNA plasmidico supercoil trasfettato in cellule di mammifero, La rivista di medicina genetica 11 (2009) 444–453. https://doi.org/10.1002/jgm.1310.
5. Arjun Dhanoya, Benjamin M. Chain, Eli Keshavarz-Moore, L'impatto della topologia del DNA sull'assorbimento dei poliplessi e sull'efficienza di trasfezione in cellule di mammifero, Giornale di Biotecnologia 155 (2011) 377–386. https://doi.org/10.1016/J.JBIOTEC.2011.07.023.
6. Fani Sousa, Duarte M.F. Prazeres, João A. Queiroz, Miglioramento dell'efficienza di trasfezione mediante l'uso di DNA plasmidico superavvolto purificato con cromatografia di affinità con l'arginina, La rivista di medicina genetica 11 (2009) 79–88. https://doi.org/10.1002/JGM.1272.