I metodi tradizionali di coltura cellulare 2D sottopongono le cellule a uno stato architettonico non fisiologico. Quando vengono coltivate in 2D, le cellule dei mammiferi assumono uno stato bipolare con un lato basale e uno apicale. Per far fronte a questa morfologia innaturale, avviene un rimodellamento citoscheletrico e la conseguente ultrastruttura della cellula viene notevolmente alterata (Ravi et al., 2015). Le cellule coltivate in 2D hanno inoltre accesso illimitato a ossigeno, nutrienti e metaboliti, cosa che non avviene nei rispettivi tessuti in vivo. Queste limitazioni fanno sì che i laboratori che eseguono test su cellule in questo ambiente innaturale producano risultati meno affidabili in vitro.

La coltura cellulare 3D crea un'architettura tridimensionale per la crescita delle cellule, offrendo un ambiente più stretto e fisiologicamente rilevante. La crescita delle cellule su scaffold 3D promuove interazioni accurate tra cellule e ambiente extracellulare con accesso variabile a ossigeno, nutrienti e metaboliti. Le cellule di mammifero che si trovano in un ambiente più rappresentativo, che riflette il loro tessuto ospite in vivo, mostrano un'espressione genica, una topologia di splicing e biomarcatori più rilevanti in vitro, che a loro volta offrono una maggiore affidabilità in termini di modellizzazione di farmaci e tossicità in laboratorio (Lv et al., 2016).

 Progettazione del ponteggio

Studi recenti dimostrano l'importanza dei gradienti di ossigeno discreti nel movimento delle cellule attraverso l'interfaccia dell'impalcatura (Ardakani et al, 2014). Le cellule cresciute su strutture a pila hanno tipicamente una distribuzione eterogenea, con ammassi comuni. Introducendo un gradiente discreto di ossigeno attraverso l'interfaccia della nostra impalcatura 3D in PETG, incoraggiamo la proliferazione cellulare dal centro alla periferia. Il risultato è un sistema molto più equilibrato di cellule sull'impalcatura, con modelli di confluenza simili a quelli dei tessuti in vivo.

Copner Biotech ha sviluppato un software di modellazione 3D su misura e una tecnica di stampa 3D di nuova generazione per creare queste architetture complesse. Il nostro processo di produzione additiva dimostra un'elevata coerenza tra i lotti, riducendo al minimo le variabili nei modelli cellulari 3D.

 

Lavoro di validazione della microstruttura dello scaffold - Lavoro di validazione della microstruttura dello scaffold - (A sinistra) Vista dall'alto dello scaffold in PETG utilizzando un microscopio ottico standard. (A destra) Sezione trasversale di uno scaffold in PETG acquisita con la microscopia elettronica a scansione (SEM).

Protocolli di sterilizzazione e semina delle cellule

Note prima di iniziare

• Prima dell'uso, gli scaffold devono essere resi idrofili con un lavaggio con etanolo al 70% per 15 minuti. Prima dell'uso, gli scaffold devono essere posizionati nell'orientamento corretto (vedi figura sotto). Durante il lavaggio con etanolo, assicurarsi di pipettare accuratamente la soluzione attraverso i pori interconnessi dello scaffold.
• Aggiungere una quantità di etanolo sufficiente a coprire completamente lo scaffold, rimuoverlo e lavarlo due volte con il terreno di coltura appropriato (2 ml).
• Per evitare l'essiccamento, lasciare lo scaffold nel mezzo di coltura finale (2 ml) fino a quando non è necessario.
• Si consiglia di lasciare lo scaffold in questo terreno finale per 4 ore per migliorare il successivo attaccamento delle cellule.

Orientamento corretto del ponteggio - Il ponteggio all'estrema sinistra rappresenta l'orientamento corretto per l'uso, mentre gli altri sono capovolti. Si noti che la base dei ponteggi può avere un aspetto diverso.

Semina di cellule su scaffold

• Rimuovere tutti i terreni di coltura cellulare dal pozzetto prima della semina, mediante una pipetta.
• Pipettare lentamente la densità cellulare desiderata tramite una soluzione di terreno cellulare da 100ul sulla parte superiore dello scaffold, facendo attenzione che la soluzione permei il più possibile i pori interconnessi.
• Riporre gli scaffold seminati nell'incubatore per 3 ore per consentire l'attaccamento delle cellule.
• Dopo 3 ore di incubazione, riempire il pozzetto rimanente con 1,4 ml di terreno completo.
• Cambiare il terreno di coltura ogni 2 giorni fino alla fine della coltura.
• Le cellule possono essere recuperate dallo scaffold dopo un trattamento con tripsina 1X per 15 minuti.
• Si consiglia di utilizzare inizialmente diverse densità cellulari per ottimizzare il protocollo di coltura prima degli esperimenti.
• La densità cellulare raccomandata va da 150.000 a 500.000 cellule per scaffold.

Attacco cellulare

Gli scaffold 3D in PETG di Copner Biotech mediano efficacemente l'attaccamento di cellule di mammifero, pur utilizzando basse concentrazioni di semina cellulare. Le cellule utilizzate finora includono, ma non solo, fibroblasti L929, cheratinociti, cellule HeLa, cellule MCF-7, cellule A549 e iPSC.

Immagini di microscopia elettronica a scansione (SEM) di cellule L929 cresciute su scaffold PETG al giorno 7 (50K cellule seminate al giorno 1). Le cellule mostrano una migrazione riuscita dal centro alla periferia dello scaffold, creando un sistema cellulare equilibrato e confluente nel processo.

Il nostro sistema operativo di stampa 3D su misura, unito alla tecnologia di stampa ad alta precisione, consente di creare regioni specifiche dell'impalcatura con una rugosità superficiale ottimale. Queste regioni danno origine alle prime cellule attaccate con successo dal primo giorno di semina e fungono da punto di partenza per la proliferazione e la migrazione delle cellule verso la periferia. La migrazione è stimolata da gradienti discreti di ossigeno e nutrienti attraverso l'interfaccia dello scaffold, formati dall'eterogeneità delle dimensioni e della distribuzione dei pori.

Vitalità cellulare

Il nostro materiale PETG è stato modificato per ottimizzare la rugosità della superficie e quindi migliorare l'attaccamento e la proliferazione delle cellule. Questo materiale inerte e non citotossico è stato confermato sicuro per l'uso in coltura cellulare, non mostrando effetti negativi sulla crescita o sulla funzione delle cellule, rendendo più facile la transizione dalla coltura cellulare 2D a quella 3D.
Gli scaffold 3D in PETG sono inoltre rigidi e non si degradano, il che li rende molto facili da usare per la coltura a lungo termine delle cellule.

Citotossicità (A) Rilascio di LDH (n=3) rilevato dalla densità ottica a 490 nm (B) Intensità di fluorescenza relativa del test alamarBlue (n=3). La linea cellulare L929 a una densità di 1 x 104 cellule è stata coltivata con terreni di controllo, terreni condizionati del giorno 1 o terreni condizionati del giorno 7 per 24 ore a 37°C. La Figura 13 mostra (A) il rilascio di LDH (n=3) per ciascuna condizione di trattamento, come rilevato dalla densità ottica a 490 nm (B) l'intensità di fluorescenza relativa del saggio almarBlue (n=3) per ciascuna condizione di trattamento. Significatività statistica determinata dal test di Friedmans; * p <0,05.

Proliferazione cellulare

Il nostro materiale PETG media gli eventi di divisione cellulare, riducendo al minimo la perdita di cellule e consentendo un'espansione significativa delle colture in un breve lasso di tempo. Ciò è particolarmente utile per chi vuole studiare le cellule nella fase di crescita esponenziale o per studiare gli eventi di divisione cellulare in tempo reale.

Le cellule L929 hanno dimostrato una capacità nettamente maggiore di formare punti di adesione focale allungati su scaffold 3D PETG, rispetto alla coltura 2D standard. L'adesione focale alle varie superfici dello scaffold è importante per l'avvio di vari segnali, che stimolano ulteriormente la proliferazione e la differenziazione cellulare (Lee et al, 2004).

(Sinistra) Intensità di fluorescenza relativa del test alamarBlue (n=3) ai punti temporali: giorno 1 e giorno 7.
7. Significatività statistica determinata con il test t a coppie; * p < 0,05, ** p < 0,01. (A destra) Punti di adesione focale allungati, che indicano una morfologia sana dei fibroblasti nella coltura 3D.

Formazione di sferoidi

Quando si utilizzano alte concentrazioni di semina cellulare e si coltiva per un periodo prolungato (7 giorni+), gli scaffold 3D in PETG favoriscono la formazione di colture sferoidi. I sistemi di coltura sferoidale forniscono un ambiente fisico-chimico simile a quello in vivo, facilitando le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice per superare le limitazioni delle colture 2D tradizionali.

Il sistema di scaffold 3D in PETG è dotato di pori interconnessi in tutta la struttura ed è progettato per la coltura e il prelievo di colture sferoidali con facilità. Utilizzando il foro centrale dello scaffold, gli utenti possono aspirare e raccogliere le colture di sferoidi pipettando verso l'alto e verso il basso con una forza minima. Questo nuovo metodo di coltura e raccolta di sferoidi consente agli utenti di creare modelli di sferoidi 3D affidabili, senza ricorrere a più passaggi e senza introdurre errori umani nella gestione degli sferoidi.

 

Immagini SEM di sferoidi dermici coltivati su Scaffold 3D PETG. I fibroblasti e i cheratinociti sono stati coltivati per 7 giorni, dopo la semina alla concentrazione di 100K il primo giorno. Gli sferoidi sono stati facilmente raccolti dagli scaffold aspirando con una pipetta e hanno mostrato danni ridotti rispetto ai metodi di raccolta dai sistemi idrogel.

Formazione di organoidi

Oltre alla formazione di sferoidi, se utilizzati in combinazione con i fattori di crescita appropriati, gli scaffold 3D possono essere utilizzati per generare corpi embrionali precoci e successivamente organoidi. Gli scaffold possono essere utilizzati per la coltura a lungo termine degli organoidi, grazie alla loro struttura robusta e alla loro resistenza.

Figura - Le prime strutture di corpi embrionali (immagine in alto a sinistra) possono essere prelevate dalla struttura dell'impalcatura e coltivate ulteriormente per formare strutture organoidi più grandi e complesse (immagine in alto a destra) in piastre a basso attacco. Le strutture cellulari possono essere colorate e visualizzate al microscopio durante e dopo la coltura (immagine in basso a destra).

Product Details