NeoStress

Test neostress antiossidante su cellule vive è stato sviluppato a partire dalla tecnologia Light Up Cell System che consente un monitoraggio fine della produzione intracellulare di ROS. La tecnologia è stata ottimizzata per un elevato throughput su piastre da 96 e 384 pozzetti, adatte ai lettori di fluorescenza commerciali, secondo un protocollo semplice che si limita all'aggiunta della soluzione A1 nel terreno di coltura e a venti serie di misurazioni di illuminazione/fluorescenza.

Meccanismo

Neostress si basa sull'attivazione di un fotosensibilizzatore intracellulare in un protocollo che richiede solo una successione di lampi di luce e letture di fluorescenza. Il processo è chiamato sistema cellulare light-up perché il livello di fluorescenza del biosensore aumenta durante la sua fotoinduzione per illuminazione. Il biosensore entra passivamente nelle cellule, ma viene rapidamente rimosso dalle cellule funzionali dalle proteine di trasporto di efflusso, dando luogo a un basso segnale di fluorescenza. Quando viene applicata la luce, la fotoinduzione del biosensore genera ROS intracellulari, che alterano l'omeostasi cellulare o la capacità della cellula di rilasciare il biosensore, innescando il suo ingresso massiccio all'interno delle cellule e determinando un aumento del segnale di fluorescenza. L'aumento della fluorescenza è ritardato o abolito nelle cellule precedentemente incubate con una sostanza antiossidante che agisce neutralizzando i radicali liberi prodotti dalle cellule sotto illuminazione.

Caratteristiche:

• Per 400 punti di misura in piastre da 96 pozzetti
• Procedura in un'unica fase
• Nessun lavaggio
• Conservazione a 4°C
• Tempo di scadenza: 6 mesi dal ricevimento
• Procedura standard per la maggior parte delle cellule primarie, hiPSC, linee cellulari immortalizzate, ... (kit di ottimizzazione disponibile se necessario)
• Può essere utilizzato in multiplexing

Protocollo generale del saggio

1. Preparare i campioni concentrati 10X
2. Per la condizione di controllo positivo, aggiungere 63μL di terreno di coltura senza siero nella provetta della Soluzione B. Miscelare con la pipetta
3. Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule, quindi aggiungere 90μL di terreno di coltura senza siero.
4. Aggiungere 10μL di controllo positivo e di condizioni campione ai pozzetti.
5. Incubare per 1 ora in incubatore
6. Per 96 pozzetti, preparare 3,13μL di soluzione A1 + 2596,9μL di terreno di coltura senza siero. Miscelare con la pipetta
7. Aggiungere 25μL di questa soluzione A1 diluita per pozzetto. Evitare l'esposizione a luce eccessiva durante questa fase e le fasi successive.
8. Incubare la piastra al tempo stabilito durante l'ottimizzazione del protocolo a temperatura ambiente.
9. Leggere la fluorescenza (Fpre) alle seguenti lunghezze d'onda:
10. λEccitazione= 505nm (±10nm)
11. λEmissione= 535nm (±10nm)
12. Illuminare la piastra con l'illuminatore AOP (AOPLight B1 o AOPLight HTS).
13. Leggere la fluorescenza (Fpost)
14. Ripetere i passaggi 10 e 11 per venti volte

N.B.: La fluorescenza non specifica può essere misurata leggendo la fluorescenza prima del passaggio 6.

Sicurezza

Questo prodotto è solo per scopi di ricerca e non per uso umano o terapeutico. Potenzialmente dannoso. Evitare l'esposizione prolungata o ripetuta. Evitare che il prodotto entri negli occhi, sulla pelle o sugli indumenti. Lavarsi accuratamente dopo la manipolazione. In caso di contatto con gli occhi o con la pelle, lavare le aree interessate con abbondante acqua per 15 minuti e consultare un medico. In caso di inalazione o ingestione, spostare l'individuo all'aria aperta e consultare immediatamente un medico.

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