Protocollo per la citometria a flusso intracellulare

I. Materiale richiesto
Reagenti
- Un anticorpo primario contro la molecola bersaglio.
- Un anticorpo secondario  nei casi di colorazione indiretta con un anticorpo primario non marcato.
- Un isotipo di controllo non rilevante con un'etichetta simile a quella dell'anticorpo primario
Buffer
- Un tampone di colorazione
- Tampone di permeabilizzazione
- Un tampone di fissazione intracellulare

Materiale
- Pipette e Pipet-aid
- Centrifugatore
- Congelatore
- Citometro a flusso


II. Durata della sperimentazione
- Stimolazione delle cellule (dipende dal tipo di cellula)
- 2 - 3 ore di incubazione degli anticorpi
- Da 30 mn a 1 h di lettura dei campioni con il citometro a flusso (dipende dal numero di campioni, dalla concentrazione delle cellule e dalla capacità del citometro)
- TOTALE: da 3 a 4 ore


III. Protocollo

- Preparare le cellule secondo il protocollo di adattamento cellulare
- Colorare le cellule secondo le raccomandazioni del protocollo generale per le cellule in sospensione.
- Dopo il primo lavaggio, fissare le cellule con 100 µl di tampone di fissazione e agitare le provette al vortex.
- Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente in una stanza buia.
- Centrifugare per 5 minuti (300-400g) a 4°C.
- Aggiungere 1 ml di tampone di permeabilizzazione
- Centrifugare per 5 minuti (300-400g) a 4°C.
- Aggiungere 20 µl di anticorpo primario diluito a una concentrazione ottimale (secondo il produttore) di 0,5-0,6 µg / 106 cellule) nel tampone di permeabilizzazione e agitare con un vortex.
- Incubare le provette per 20 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 1 ml di tampone di permeabilizzazione
- Centrifugare per 5 minuti (300-400g) a 4°C.
- Risospendere le cellule in 500 µl di tampone di analisi o di tampone di fissazione integrato con il 2% di formaldeide.
- Leggere le cellule in un citometro a flusso


IV. Motori di ricerca
- Anticorpi primari 
- Anticorpi secondari