Protocollo di rivelazione amplificato: Gamma DBS
I. Materiale richiesto
Reagenti
- Anticorpo primario
- Diluente per anticorpo primario
- Soluzione di pre-blocco
- Mezzo di montaggio
Buffer
- Tampone di lavaggio immunologico
- Xilene o reagenti deceranti
- Etanolo assoluto
- Acqua distillata o deionizzata
II. Durata della sperimentazione
- 10 mn di blocco
- 30-60 mn di incubazione delle sezioni con l'anticorpo primario
- 36 o 31 milioni di altri incubati
- 20 mn di fasi di risciacquo
- TOTALE : da 1h31 a 2h06
III. Procedura di colorazione
1. Blocco della perossidasi. Incubare i vetrini nel blocco della perossidasi per 5 minuti.
Sciacquare i vetrini 3 volte per 1 minuto con il tampone di lavaggio immunologico.
2. Pre-blocco (opzionale). Aggiungere 2 gocce (100 µL) o un volume di soluzione di pre-bloccaggio sufficiente a coprire la sezione di tessuto (10 minuti).
Scolare o tamponare la soluzione. Non sciacquare.
3. Anticorpo primario. Incubare con l'anticorpo primario per 30-60 minuti, preparato secondo il protocollo raccomandato dal produttore alla concentrazione desiderata. Gli anticorpi primari concentrati possono essere diluiti con il diluente per anticorpi primari.
Lavare i vetrini 3 x 1 minuti in tampone di lavaggio immunologico
4. Potenziatore della penetrazione dei polimeri. Applicare il potenziatore di penetrazione del polimero e incubare per 10 minuti.
Sciacquare i vetrini 3 volte per 1 minuto con il tampone di lavaggio immunologico.
5. Etichetta PolyVue. Incubare il tessuto con il reagente PolyVue HRP Label per 10 minuti.
Lavare i vetrini 3 x 1 minuti con Immuno Wash Buffer
6. DAB/Plus stabile. Preparare la soluzione di lavoro del substrato DAB/Plus stabile (vedi sopra).
Incubare il tessuto per 5-10 minuti con la soluzione di substrato DAB/Plus stabile preparata. Monitorare il livello di colorazione per determinare il tempo di incubazione ottimale.
Sciacquare i vetrini 3 x 1 minuti con acqua.
7. Controsenso. Incubare il tessuto per 1 minuto con il controcolore (es. ematossilina).
Lavare i vetrini 3 x 1 minuto in acqua, quindi 1 x 1 minuto in tampone di lavaggio immunologico, quindi 1 x 1 minuto in acqua.
8. Disidratare e ricoprire. Disidratare i tessuti attraverso una serie graduata di etanolo, seguita da una serie di xilene.Applicare sui vetrini coprioggetto un mezzo di montaggio permanente.
IV.Motore di ricerca
- Anticorpo primario