Protocollo sperimentale per il Western Blotting

 

Separazione delle proteine mediante elettroforesi su gel

Prima di eseguire il Western blot, le proteine di un campione devono essere separate in base alle loro dimensioni. In genere, ciò avviene mediante SDS-PAGE (Sodium Dodecyl-Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis), in cui la concentrazione di poliacrilammide e il sistema tampone influenzano la mobilità delle proteine attraverso il gel a seconda del loro peso molecolare. Il gel nella SDS-PAGE presenta due strati distinti, definiti gel di “impilamento” (strato superiore) e gel di “separazione” o “risoluzione” (strato inferiore).

Come indicato nella tabella seguente, la concentrazione del gel risolvente deve corrispondere alle dimensioni della proteina target.

Dimensione della proteina (kDa)	Concentrazione di poliacrilammide
≥500	5%
25-200	8%
15-100	10%
10-70	12.5%
12-45	15%
4-40	20%

I gel SDS-PAGE possono essere acquistati o facilmente realizzati in casa. Una ricetta comune per preparare un gel SDS-PAGE è la seguente. Se si utilizza un gel già pronto, passare alla sezione successiva.

Reagenti	6% Gel di impilamento	10% Gel di separazione
ddH2O	2 mL	3 mL
1 M Tris-HCl	400 uL pH 6.7	2.1 mL pH 8.9
30% Acrilammide/Bis-acrilammide	600 uL	2.8 mL
10% SDS	36 uL	80 uL
10% APS (Persolfato di ammonio)	24 uL	50 uL
TEMED (TetraMetilEtileneDiammina)	4 uL	6 uL

1. Assemblare il kit di colata in gel seguendo le istruzioni del produttore. Questo include l'inserimento delle piastre di vetro nel telaio di colata e il loro bloccaggio in posizione.
2. Inserire il telaio di colata nel supporto di colata. Posizionare il pettine in modo appropriato.
3. Con un pennarello, segnare il vetro ~ 1 cm sotto il pettine. Questo indica il livello di gel separatore necessario.
4. Rimuovere il pettine. Con una pipetta, aggiungere una piccola quantità di acqua nella camera del gel per verificare che non ci siano perdite. Rimuovere l'acqua con una salvietta KimWipe.
5. Mescolare tutti gli ingredienti del gel separatore, assicurandosi di aggiungere TEMED per ultimo.
6. Pipettare il gel separatore nella camera, fino al pennarello.
7. Per rimuovere le bolle, versare delicatamente una piccola quantità di alcol isopropilico (IPS) sulla parte superiore del gel. Lasciare indurire il gel per 30 minuti.
8. Rimuovere l'IPA inserendo delicatamente una KimWipe nella camera.
9. Mescolare tutti gli ingredienti del gel di impilamento, assicurandosi di aggiungere TEMED per ultimo.
10. Pipettare il gel di impilamento nella camera, fino alla parte superiore della piastra di vetro.
11. Inserire il pettine. Lasciare indurire il gel per altri 30 minuti.

 

Preparazione del campione

Le proteine vengono tipicamente estratte da cellule o tessuti utilizzando vari tamponi di estrazione contenenti detergenti, sali e inibitori delle proteasi per mantenere l'integrità e la stabilità delle proteine.

La quantità di proteine presenti nel campione viene stimata con i seguenti metodi:

1. Metodo diretto basato sull'assorbimento a 280 nm mediante spettroscopia UV.
2. Test Bradford sulle proteine (calcolatore del test Bradford)
3. Test di quantificazione delle proteine BCA (kit Amplite® Colorimetric o Amplite® Fluorimetric o Portelite™ Fluorimetric Assay).

Per denaturare le proteine e interrompere le interazioni non covalenti, al tampone del campione viene aggiunto un agente riducente come il β-mercaptoetanolo o il ditiotreitolo (DTT). Inoltre, il riscaldamento dei campioni a circa 95°C per 5 minuti o a 70°C per 10 minuti aiuta a denaturare completamente le proteine. Ai campioni proteici viene aggiunto un colorante di carico per aumentarne la densità, fornire un colore per la visualizzazione e seguire la migrazione dei campioni durante l'elettroforesi. Il colorante contiene tipicamente un colorante di tracciamento (ad esempio, blu di bromofenolo o cianolo di xilene) e un agente denso (ad esempio, glicerolo) per aiutare i campioni ad affondare nei pozzetti.

Elettroforesi su gel

Attrezzatura necessaria :

• Camera di elettroforesi e alimentatori
• Micropipetta

Reagenti necessari :

• Gel SDS-PAGE
• Tampone di corsa 1X (Ricetta per il tampone di corsa 10X)
• Campioni di proteine
• Ladder di proteine (PageTell™ Prestained 10-250 kDa Ladder o ProLite™ 5-245 kD Protein Ladder)

 

1. Inserire la cassetta del gel nella camera dell'elettrodo. Posizionare la camera dell'elettrodo nella vasca di elettroforesi.
2. Rimuovere il pettine sul gel.
3. Aggiungere ~200 mL di tampone di corsa 1x alla camera interna dell'elettrodo.
4. Riempire la camera esterna del serbatoio fino al segno dell'indicatore presente all'esterno del serbatoio. Assicurarsi che il tampone di corsa copra completamente il gel.
5. Riscaldare i campioni in un bagno d'acqua a 95°C per 5 minuti o a 70°C per 10 minuti.
6. Aggiungere i campioni e i ladder proteici ai pozzetti identificati. Il volume dipende dal campione, ma generalmente è compreso tra 5 e 15 uL per pozzetto. Il volume di ciascuna corsia deve essere reso uguale utilizzando ddH20 o tampone di lisi.
7. Collegare il serbatoio per elettroforesi all'alimentatore, il rosso (+) al rosso, il nero (-) al nero.
8. Eseguire il gel per il voltaggio e il tempo desiderati. In genere, questi parametri sono 100-150 V per 40-60 minuti.

Le proteine separate sul gel possono essere colorate con ProLite™ Orange Protein Gel Stain per visualizzare le proteine totali presenti sul gel.

Elettrotrasferimento

Successivamente, le proteine separate presenti sul gel vengono trasferite su una membrana attraverso un processo chiamato elettrotrasferimento (anche elettroblotting).

Attrezzatura necessaria :

• Apparecchio di trasferimento
• Spugna o schiuma, tagliata alla stessa dimensione del gel
• 6 carte da filtro, tagliate alla stessa dimensione del gel
• Vassoio di montaggio o cassetta per blotting

Reagenti necessari :

• Il ghiaccio
• Metanolo
• Membrana in PVDF (fluoruro di polivinilidene) o nitrocellulosa, tagliata alle stesse dimensioni del gel.
• Tampone di trasferimento 1X (Ricetta per il tampone di trasferimento 20X)

 

1. Bagnare la spugna, le carte da filtro e la membrana con metanolo.
2. Estrarre con cautela il gel dalla cassetta del gel.
3. Assemblare con cura un sandwich elettro-trasferibile impilandolo nell'ordine seguente:

   • (a) Fondo del vassoio di montaggio

   • (b) Spugna a pressione

   • (c) Carte da filtro

   • (d) Gel

   • (e) Membrana in PVDF

   • (f) Carte da filtro

   • (g) Vassoio di montaggio superiore

4. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria nel panino. Spremere delicatamente il liquido in eccesso.
5. Posizionare il sandwich nella vasca di elettroblottizzazione, con ghiaccio.
6. Aggiungere il tampone di trasferimento alla vasca di elettroblottizzazione, coprendo completamente il sandwich.
7. Collegare il serbatoio per elettroblocchi all'alimentazione, il rosso (+) al rosso, il nero (-) al nero.
8. Far funzionare il sistema di elettroblottatura per la durata desiderata, compresa tra 45 e 90 minuti.

 

Blocco

Una fase di blocco impedisce agli anticorpi di legarsi in modo non specifico alla membrana. Il blocco rimuove il potenziale rumore di fondo dalla membrana, semplificando l'analisi delle proteine. I bloccanti comunemente utilizzati sono BSA al 2-5% o latte secco non grasso in soluzione salina tamponata (TBS o PBS).

Tabella 1. Confronto tra i tamponi di blocco per il western blotting.

Buffer di blocco	Vantaggi	Considerazioni
Latte scremato	Poco costoso Contiene più tipi di proteine	Contiene biotina e fosfoproteine, che possono interferire con le strategie di rilevamento della streptavidina-biotina e con il rilevamento delle proteine target fosforilate. A causa del numero di proteine presenti nel latte, il latte può mascherare alcuni antigeni e abbassare il limite di rilevazione del western blot.
Proteine purificate	I tamponi bloccanti monoproteici possono offrire minori possibilità di reazione incrociata con i componenti del saggio rispetto alle soluzioni di siero o latte. Ideale quando i bloccanti, come il latte magro, bloccano il legame antigene-anticorpo.	Più costoso rispetto alle formulazioni tradizionali di latte non grasso.
Sieroalbumina bovina (BSA)	Single-protein blocking buffers may offer less chance of cross-reaction with assay components than serum or milk solutions.Ideal when blockers, such as low-fat milk, block antigen-antibody binding.	Sono disponibili in commercio diverse qualità di BSA che possono influire sul rapporto segnale/rumore. La BSA è generalmente un blicker più debole, che può determinare un maggiore legame non specifico con l'anticorpo, ma può aumentare la sensibilità di rilevamento per le proteine poco abbondanti.

 

Incubazione degli anticorpi primari e secondari

La proteina di interesse in un Western blot può essere rilevata utilizzando un anticorpo primario marcato o un anticorpo primario non marcato + un anticorpo secondario marcato.

1. Aggiungere alla membrana l'anticorpo primario in BSA (sieroalbumina bovina) al 5%.
2. Incubare la membrana per una notte a 4°C su un agitatore o per 1 ora a temperatura ambiente.
3. Se si utilizza un anticorpo secondario, lavare la membrana tre volte con TBST. Incubare la membrana con l'anticorpo secondario per 1 ora a temperatura ambiente.
4. Lavare la membrana tre volte con TBST.

Rilevamento

Nel Western blotting, i metodi di rilevazione vengono utilizzati per visualizzare e quantificare la presenza di proteine specifiche che sono state trasferite dal gel alla membrana. Si possono utilizzare diversi metodi di rilevazione, a seconda dei requisiti specifici dell'esperimento e del tipo di etichetta presente nell'anticorpo di rilevazione.

Ecco alcuni metodi di rilevazione comunemente utilizzati nel Western blotting:

Chemiluminescenza

I substrati chemiluminescenti, come Amplite® West ECL HRP Substrate, generano luce in seguito alla reazione enzimatica con la perossidasi di rafano (HRP) o la fosfatasi alcalina (AP), coniugate ad anticorpi secondari. È un metodo sensibile e fornisce un segnale di lunga durata.

Fluorescenza

Gli anticorpi secondari marcati in modo fluorescente si legano direttamente agli anticorpi primari, oppure gli anticorpi primari vengono rilevati utilizzando anticorpi secondari coniugati con fluorofori. Questo approccio consente capacità di multiplexing, elevata sensibilità e compatibilità con vari sistemi di imaging.

La Guida alla selezione degli anticorpi e delle proteine può essere utile per la pianificazione di Western blotting e altri test immunologici, fornendo informazioni sulla scelta degli anticorpi più adatti alle specifiche esigenze sperimentali.

Rilevamento colorimetrico

I substrati enzimatici producono un prodotto di reazione colorato alla reazione con HRP o AP coniugati con anticorpi secondari che possono essere utilizzati per visualizzare le proteine in western blot.

Analisi

Nell'analisi dei Western blot, le immagini chiare dei blot vengono acquisite con apparecchiature specializzate. L'intensità delle bande può essere quantificata con un software per l'analisi delle immagini, spesso normalizzando rispetto ai controlli interni per ottenere confronti accurati. I test statistici valutano le differenze tra i campioni analizzati, aiutando a trarre conclusioni significative.

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