Cas9 est une protéine de 160 kilodaltons qui est un composant essentiel du système immunitaire adaptatif CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) chez certaines bactéries. C'est une enzyme endonucléase guidée par ARN.

Mécanisme d'Action

Cas9 interroge l'ADN en déroulant l'ADN étranger et en recherchant des sites complémentaires à la région d'espacement de 20 nucléotides de l'ARN guide (gRNA). Si le substrat ADN est complémentaire à l'ARN guide, Cas9 clive l'ADN envahissant. Une fois que Cas9 a trouvé un site cible avec le PAM approprié, il déclenche une fusion locale de l'ADN suivie de la formation d'un hybride ARN-ADN, mais le mécanisme par lequel l'enzyme Cas9 fait fondre la séquence cible de l'ADN n'est pas encore bien compris. Ensuite, la protéine Cas9 est activée pour le clivage de l'ADN. Le complexe Cas9:crRNA:tracrRNA reconnaît l'ADN étranger en utilisant la séquence PAM et la complémentarité ADN:ARN, ce qui déclenche l'action catalytique de Cas9. La nucléase Cas9 crée des cassures double-brin (DSB) à un site situé à 3 paires de bases en amont du PAM.

Structure

Cas9 présente une architecture en deux lobes avec l'ARN guide situé entre le lobe alpha-hélicoïdal (bleu) et le lobe nucléase (cyan, orange et gris). Ces deux lobes sont reliés par une hélice de pont unique. Il y a deux domaines nucléases situés dans le lobe nucléase multi-domaines, le RuvC (gris) qui clive le brin d'ADN non-cible, et le domaine nucléase HNH (cyan) qui clive le brin cible d'ADN. Une caractéristique clé de l'ADN cible est qu'il doit contenir un motif adjacent de protospacer (PAM) composé de la séquence de trois nucléotides NGG.

dCas9

Les deux résidus catalytiques cruciaux du domaine RuvC et HNH peuvent être mutés en alanine, abolissant ainsi toute activité endonucléase de Cas9. La protéine résultante, appelée « dead » Cas9 ou « dCas9 », peut toujours se lier fermement à l'ADN double-brin (dsDNA). Cette variante inactivée de Cas9 a été utilisée pour des études mécanistiques sur la liaison interrogative de l'ADN par Cas9 et comme un complexe ARN-protéine programmable de liaison à l'ADN.