Mixes et kits pour la RT-PCR

Pour les applications de RT-PCR, il existe 2 approches : la RT-PCR en une étape et la RT-PCR en deux étapes.  Chacune de ces méthodes à ses avantages et ses inconvénients. Comme son nom l'indique, la RT-PCR en une seule étape combine la synthèse de l'ADN complémentaire (ADNc) du premier brin (la transcription inverse, RT) et la PCR subséquente dans un seul tube de réaction. Cette configuration de réaction simplifie le travail, réduit les variations et minimise les contaminations possibles. La RT-PCR en une seule étape permet de traiter plus facilement un grand nombre d'échantillons, ce qui permet d'effectuer des applications à haut débit. Cependant, la RT-PCR en une étape utilise des amorces spécifiques de gène pour l'amplification, limitant l'analyse à quelques gènes par échantillon d'ARN. Comme la réaction est un compromis entre les conditions de transcription inverse et d'amplification, la RT-PCR en une seule étape pourrait être moins sensible et moins efficace dans certains cas. Cependant, l'utilisation d'une amorce spécifique du gène dans la RT-PCR peut aider à maximiser le rendement de l'ADNc cible et minimiser l'amplification.

La RT-PCR en deux étapes implique deux réactions distinctes, à commencer par la synthèse de l'ADNc du premier brin (transcription inverse - RT), puis l'amplification d'une partie de l'ADNc résultant par PCR dans un tube séparé. Par conséquent, la RT-PCR en deux étapes est utile pour détecter de multiples gènes dans un seul échantillon d'ARN. La séparation des réactions RT et PCR permet d'optimiser les conditions réactionnelles pour chaque étape ainsi que la souplesse avec l'amorçage par transcription inverse (amorces oligo (dT), hexamères aléatoires ou amorces spécifiques de gènes) et PCR (par exemple choix d'ADN polymérase et des composants PCR). Comparés à la RT-PCR en une étape, les inconvénients de la RT-PCR en deux étapes incluent plusieurs étapes pour un flux de travail étendu, une manipulation et un traitement supplémentaires de l'échantillon, et augmentent les risques de contamination et de variation des résultats.