Production améliorée de plasmides : Multiplier par 21 le nombre de plasmides

Introduction 

La demande d'ADN plasmidique (ADNp) a augmenté au cours des dernières années en raison de la forte demande de thérapies géniques et de vaccinations par l'ADN (l'ADNp est couramment utilisé en raison de sa grande sécurité). Par conséquent, une production accrue d'ADNp avec un système de purification et de contrôle de la qualité rentable, reproductible et fiable est très demandée. Les plasmides sont généralement produits dans des cellules Escherichia coli (E. coli), puis isolés par une série d'étapes de purification. Bien qu'E. coli produise principalement l'isoforme la plus compacte de l'ADN plasmidique (ADNp) super enroulé (SC), des isoformes d'ADNp circulaires ouvertes (OC), entaillées, linéaires et dénaturées sont généralement également présentes. L'apparition de différentes isoformes peut être due à des changements de conformation qui se produisent dans l'hôte bactérien et au cours du traitement de la biomasse (par exemple, la lyse cellulaire) et des étapes de purification des plasmides [1]. Plusieurs sources de données indiquent que des niveaux élevés de SC sont nécessaires pour déclencher une réponse immunitaire efficace et, en fin de compte, une protection contre les infections [2,3]. En outre, l'isoforme SC de l'ADNp est l'isoforme souhaitée pour la transfection, car elle permet une transfection plus efficace grâce à sa structure plus compacte que les variantes OC ou linéaires [4-6].

La chromatographie d'échange d'anions (CEA) est une méthode courante pour purifier l'ADNp SC des autres isoformes plasmidiques et pour éliminer les impuretés présentes provenant de l'organisme hôte. Idéalement, le processus de production en amont fournit déjà un ADNp SC de grande qualité. 

Matériels et méthodes 

Transformation et culture

Le plasmide pCMV3-GFP (6883 bp) contenant un gène de résistance à l'ampicilline (Sino Biological) a été transformé dans des cellules E. coli compétentes NEB 5-alpha (New England Biolabs) selon le protocole du fabricant. Le mélange de transformation a été placé sur une plaque de sélection (gélose LB avec 100 µg/mL d'ampicilline) et incubé pendant une nuit à 37°C. Une seule colonie a été choisie sur la plaque de sélection et une culture d'une nuit a été préparée dans un erlenmeyer en verre de 500 ml sans paillettes contenant 50 ml de milieu LB (tryptone 10 g/l, extrait de levure 5 g/l, NaCl 10 g/l, pH 7,0 ±0,2) avec 100 µg/ml d'ampicilline. Le flacon a été scellé avec une feuille d'aluminium et incubé à 37°C et 180 min -1 dans un incubateur-agitateur orbital avec des tapis adhésifs Sticky Stuff (INFORS HT Multitron Incubator Shaker, 25 mm shaking throw) pendant toute la nuit (au moins 18 heures). Pour la culture principale, des triplicats de flacons Erlenmeyer en verre de 250 ml sans bouchon contenant 25 ml de LB avec 100 µg/ml d'ampicilline ont été préparés, ce qui est considéré comme un modèle de culture standard.

Des triplicats de flacons Ultra Yield® de 250 mL (Thomson, P/N : 931144) contenant 100 mL de milieu Plasmid+® (Thomson, P/N : 446300) avec 100 µg/mL d'ampicilline et 0,02% d'Antifoam 204 (Sigma-Aldrich) ont été préparés. Le système de culture standard et le système de culture Thomson ont été inoculés à partir de la culture d'une nuit, avec une OD600nm de départ de 0,2. Les flacons Ultra Yield® ont été scellés avec l'AirOtop® Enhanced Seal (Thomson, P/N : 899423) et les flacons Erlenmeyer avec du papier aluminium. Les flacons ont été incubés à 37°C à 350 min -1 ou 180 min -1 dans l'agitateur INFORS HT Multitron Incubator Shaker (25 mm shaking throw) avec des pinces à flacons. Il est à noter que les tapis adhésifs Sticky Stuff ne conviennent pas pour 350 min -1 et que l'utilisation de pinces est obligatoire. Les cultures ont été cultivées pendant au moins 24 heures et des échantillons ont été prélevés à intervalles réguliers pour mesurer l'OD600nm au fil du temps.

Purification de l'ADN

Le système PureYield™ Plasmid Miniprep (Promega) a été utilisé pour la purification des plasmides. La suspension cellulaire LB a été utilisée non diluée, les suspensions cellulaires Thomson ont été diluées 9 fois pour correspondre approximativement à la valeur de la DO des échantillons LB. Chaque suspension cellulaire a été échantillonnée à raison de 600 µl, puis centrifugée, et le culot a été remis en suspension dans 600 µl d'eau exempte de nucléase. Toutes les autres étapes ultérieures ont été réalisées conformément au protocole rapide du système PureYield™ Plasmid Miniprep FB093 pour le kit A1223 ou A1222. La purification de l'ADN a été réalisée par la méthode de centrifugation. Les plasmides ont été élués avec de l'eau exempte de nucléase fournie avec le kit. La concentration en ADN et la pureté des échantillons élués ont été mesurées à 230, 260 et 280 nm avec un spectrophotomètre NanoDrop™ 2000/2000c (Thermo Fisher Scientific).

Analyse des plasmides par HPLC

Pour l'analyse des plasmides, une HPLC 1100 Series (Agilent) avec un détecteur DAD 1100 Series (Agilent, G1315B) à 260 nm a été utilisée. Les échantillons ont été mesurés sur une colonne BioPro IEX QF, 100 x 4,6 mm, 5 µm (YMC, QF00S05-1046WP). 5 µl de chaque échantillon ont été injectés et mesurés en trois exemplaires. La température de la colonne a été réglée à 35°C. La phase mobile A (20 mM Tris-HCl, pH 7,4) et la phase mobile B (20 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, pH 7,4) ont été utilisées pour éluer l'échantillon dans une méthode de gradient avec un débit constant de 0,5 ml/min. Le gradient a été effectué de la minute 0 à la minute 0,7 avec la phase mobile A (MPA) à 25 % et la phase mobile B (MPB) à 75 %. À partir de la minute 0,7, le gradient a été appliqué et la composition de 75 % de MPB a été modifiée à 100 % pendant 20 minutes jusqu'à la minute 20,7 et a été maintenue à 100 % jusqu'à la minute 24. À la minute 24,01, la composition est passée à 25 % de MPA et 75 % de MPB jusqu'à la minute 30 (fin de l'injection).

La croissance bactérienne dans des fioles Erlenmeyer avec du milieu LB (culture standard) à 350 min-1 et dans des fioles Ultra Yield® avec du milieu Plasmid+® à 350 min -1 a présenté des profils similaires jusqu'à 4 heures de culture, comme le montre la figure 1. Pour la culture à 180 min -1, les similitudes sont observées jusqu'à 8 heures. Dans le cas de la croissance bactérienne dans les flacons Ultra Yield®, le taux de croissance initial est légèrement plus lent au cours des premières heures par rapport à la culture standard.

Cependant, un net contraste entre les deux conditions de culture devient évident après 4 heures (350 min -1) et 8 heures (180 min -1). Pour l'approche de culture standard, la densité optique est réduite par rapport à la mesure effectuée à 12 heures, ce qui indique que le nombre de cellules viables est déjà en train de diminuer à ce moment-là. À la fin de la période de culture, les valeurs de densité optique du système Ultra Yield® maintenu à 180 min-1 et 350 min-1 ont dépassé celles du système de culture standard de plus de 2 fois et 7 fois respectivement.

Après purification des plasmides, le rendement total en plasmides pour la condition 180 min -1 était plus de 5 fois supérieur par flacon Thomson par rapport aux flacons Erlenmeyer (figure 2a). Lorsque la différence de volume entre les flacons est prise en compte, le rendement en plasmides est 1,4 fois plus élevé avec le système de culture Thomson qu'avec le système de culture standard. La proportion de plasmides super enroulés par rapport aux plasmides enroulés ouverts (figure 2b) était similaire entre le système de culture Thomson (67,7 % de plasmides super enroulés) et le système de culture standard (64,7 % de plasmides super enroulés).

La différence entre le système de culture Thomson et le système de culture standard est plus prononcée lorsque la culture est maintenue à 350 min -1. Dans ce cas, la quantité totale de plasmide purifié par flacon est environ 21 fois plus élevée avec le système Ultra Yield® de Thomson que dans les conditions de culture standard, ou environ 5 fois plus élevée si l'on tient compte de la différence de volume (Figure 3a). La proportion de plasmides super enroulés par rapport aux plasmides ouverts (Figure 3b) était à nouveau similaire entre le système de culture de Thomson (88,5 % de plasmides super enroulés) et le système de culture standard (88,9 % de plasmides super enroulés).

Conclusion 

Les données démontrent que les vitesses d'agitation courantes de 180 min -1 (orbite de 25 mm) ne sont pas suffisantes pour assurer une croissance cellulaire optimale dans les flacons Thomson Ultra Yield®. Une vitesse d'agitation élevée de 350 min -1 permet de multiplier par 3 le rendement de la biomasse par rapport à 180 min -1. Une meilleure croissance cellulaire a permis d'augmenter la production d'ADNp. Le succès de cette application dépend fortement du maintien d'une vitesse d'agitation élevée pour obtenir un mélange et un transfert de gaz efficaces, conduisant à des rendements plus élevés. Lorsque la vitesse d'agitation passe de 180 min -1 à 350 min -1, l'énergie cinétique nécessaire pour agiter efficacement la surface est multipliée par 4. Il est essentiel que la limite de charge de l'agitateur puisse accueillir en toute sécurité les flacons à des vitesses élevées. L'agitateur INFORS HT Multitron Incubator Shaker peut contenir 45 flacons de 250 ml, avec une masse de milieu et de culture totalisant à elle seule 4,5 kilogrammes. Si l'on tient compte de la masse supplémentaire du plateau et des pinces à flacons, la limite de charge minimale de l'agitateur devrait dépasser 12 kilogrammes. Avec des flacons plus grands, il est possible de charger plus de 10 litres de milieu dans l'agitateur, ce qui rend la limite de charge physique et les dimensions intérieures de l'agitateur extrêmement importantes. Tous ces facteurs soulignent la nécessité d'un agitateur robuste, comme l'agitateur-incubateur Multitron, pour tirer pleinement parti de ce processus.

La combinaison des flacons Ultra Yield® avec le milieu enrichi Plasmid+® et le joint amélioré AirOtop® a permis d'obtenir des densités cellulaires plus élevées et une quantité de plasmides 21 fois plus importante que dans les flacons Erlenmeyer avec le milieu LB. Le rendement global plus élevé des plasmides se traduit également par une plus grande quantité de l'isoforme plasmidique super enroulée (SC) qui est souhaitée pour la transfection des cellules de mammifères [4,5]. Si l'on considère le coût total d'un processus de production de plasmides en laboratoire, l'utilisation de flacons Thomson Ultra Yield®, du milieu Plasmid+® en combinaison avec un puissant incubateur-agitateur à 350 min -1 est moins coûteuse en mg/L de plasmides que la culture LB dans des Erlenmeyers en verre. L'investissement dans un bon agitateur permettant d'atteindre des vitesses plus élevées et dans le système Thomson est avantageux.

Utiliser AIROTOP® Seal/Vented Screw Cap Media mL/Flask Vitesse de l'agitateur (RPM)

 

Code	Description	Utiliser le bouchon AIROTOP® Seal/Vented Screw Cap	Milieu mL/flacon	Vitesse de l'agitateur (RPM)
931147	Flacons Ultra Yield® 125mL 50/CS - Stérile	899421 / 899109	35-50 mL/Flask	300-350
931144	Flacons Ultra Yield® 250mL 50/CS - Stérile	899423 / 899110	75-100 mL/Flask	300-350
931141	Flacons Ultra Yield® 500mL 25/CS - Stérile	899424 / 899111	150-200 mL/Flask	300-350
931138	Bouteilles Ultra Yield® 1,5L 12/CS - Stériles	899425 / 899566	300 mL/Flask	300-350
931136-B	Flacons Ultra Yield® 2.5L 6/CS - Stérile	899425 / 899566	500 mL/Flask	300-400
446300	Milieu enrichi Plasmid+® - Stérile	N/A	N/A	N/A

 

Références

1. D.M. Prazeres, T. Schluep, C. Cooney, Purification préparative de l'ADN plasmidique super enroulé à l'aide de la chromatographie d'échange d'anions, J. Chromatogr. A 806 (1998) 31–45. https://doi.org/10.1016/s0021-9673(97)01254-5.
2. Lionel Cupillard, Véronique Juillard, Sophie Latour, Guy Colombet, N. Cachet, S. Richard, S. Blanchard, Laurent Fischer, Impact de l'enroulement du plasmide sur l'efficacité d'un vaccin ADN contre la rage pour protéger les chats, Vaccine 23 (2005) 1910–1916. https://doi.org/10.1016/J.VACCINE.2004.10.018.
3. 3. Huangjin Li, Huaben Bo, Jinquan Wang, Hongwei Shao, Shulin Huang, Séparation des formes circulaires ouvertes et super enroulées de l'ADN plasmidique et détection de l'activité biologique, Cytotechnology 63 (2011) 7–12. https://doi. org/10.1007/s10616-010-9322.
4. Christof Maucksch, Alexander Bohla, Florian Hoffmann, Martin Schleef, Manish Kumar Aneja, Markus Elfinger, Dominik Hartl, Carsten Rudolph, Expression transgénique de concatémères d'ADN plasmidique super enroulés transfectés dans des cellules de mammifères, Le journal de la médecine génique11 (2009) 444–453. https://doi.org/10.1002/jgm.1310.
5. Arjun Dhanoya, Benjamin M. Chain, Eli Keshavarz-Moore, L'impact de la topologie de l'ADN sur l'absorption des polyplexes et l'efficacité de la transfection dans les cellules de mammifères, Journal de la biotechnologie 155 (2011) 377–386. https://doi.org/10.1016/J.JBIOTEC.2011.07.023.
6. Fani Sousa, Duarte M.F. Prazeres, João A. Queiroz, Amélioration de l'efficacité de la transfection par l'utilisation d'ADN plasmidique super enroulé purifié par chromatographie d'affinité à l'arginine, Le journal de la médecine génique 11 (2009) 79–88. https://doi.org/10.1002/JGM.1272.