Les méthodes traditionnelles de culture cellulaire en 2D soumettent les cellules à un état architectural non physiologique. Lorsqu'elles sont cultivées en 2D, les cellules de mammifères adoptent un état bipolaire avec un côté basal et un côté apical. Pour faire face à cette morphologie non naturelle, un remodelage du cytosquelette a lieu et l'ultrastructure de la cellule est considérablement altérée (Ravi et al., 2015). Les cellules cultivées en 2D ont également un accès illimité à l'oxygène, aux nutriments et aux métabolites, ce qui n'est pas le cas dans leurs tissus respectifs in vivo. Ces limitations signifient en fin de compte que les laboratoires effectuant des essais sur des cellules dans cet environnement non naturel obtiennent des résultats in vitro moins fiables.

La culture cellulaire en 3D crée une architecture tridimensionnelle pour la croissance cellulaire, offrant un environnement plus cohérent et pertinent sur le plan physiologique. La croissance des cellules sur des échafaudages en 3D favorise des interactions précises entre cellules et entre les cellules et leur environnement extracellulaire, avec un accès variable à l'oxygène, aux nutriments et aux métabolites. Les cellules de mammifères qui se trouvent dans un environnement plus représentatif, reflétant leur tissu hôte in vivo, présentent une expression génique, une topologie de l'épissage et des biomarqueurs plus pertinents in vitro, ce qui offre à son tour une fiabilité bien supérieure en termes de modélisation des médicaments et de la toxicité en laboratoire (Lv et al., 2016).

Conception du Scaffold

Des études récentes montrent l'importance des gradients d'oxygène discrets dans le mouvement des cellules à travers l'interface du scaffold (Ardakani et al, 2014). Les cellules cultivées sur des structures en forme de pile de bois présentent généralement une distribution hétérogène, avec des regroupements fréquents. En introduisant un gradient d'oxygène discret à travers l'interface de notre scaffold 3D PETG, nous encourageons la prolifération cellulaire du centre vers la périphérie. Le résultat est un système de cellules beaucoup plus équilibré sur le scaffold, avec des motifs de confluence semblables à ceux des tissus in vivo.

Copner Biotech a développé un logiciel de modélisation 3D sur mesure et une technique d'impression 3D de nouvelle génération pour créer ces architectures complexes. Notre processus de fabrication additive démontre une haute cohérence d'un lot à l'autre, minimisant les variables dans vos modèles cellulaires 3D.

 

Validation de la microstructure du scaffold - (Gauche) Vue de dessus du scaffold PETG à l'aide d'un microscope optique. (Droite) Section transversale d'un scaffold PETG capturée à l'aide d'une microscopie électronique à balayage (SEM).

Protocoles de Stérilisation et d'Inoculation des Cellules

Remarques Avant de Commencer

• Avant utilisation, les scaffolds doivent être rendus hydrophiles par un lavage à l'éthanol à 70 % pendant 15 minutes. Veuillez noter que les scaffolds doivent être placés dans la bonne orientation avant utilisation (voir figure ci-dessous). Lors du lavage à l'éthanol, assurez-vous de pipeter la solution à travers les pores interconnectés du scaffold.
• Ajoutez suffisamment d'éthanol pour couvrir complètement le scaffold, retirez et lavez 2x avec le milieu de culture approprié (2 ml).
• Pour éviter le dessèchement, laissez le scaffold dans le milieu final (2 ml) jusqu'à ce qu'il soit nécessaire.
• Nous recommandons de laisser les scaffolds dans ce milieu final pendant 4 heures pour améliorer l'adhésion cellulaire ultérieure.

Orientation Correcte du Scaffold - Le scaffold à l'extrême gauche représente l'orientation correcte pour l'utilisation, tandis que les autres scaffolds sont à l'envers. Veuillez noter que la base des scaffolds peut varier en apparence.

Inoculation des Cellules sur le Scaffold

• Retirez tout le milieu de culture cellulaire du puits avant l'inoculation, à l'aide d'une pipette.
• Pipetez lentement la densité cellulaire souhaitée avec une solution de milieu cellulaire de 100 µl sur le dessus du scaffold, en veillant à ce que la solution pénètre autant que possible dans les pores interconnectés.
• Placez les scaffolds inoculés de nouveau dans l'incubateur pendant 3 heures pour permettre l'adhésion des cellules.
• Après l'incubation de 3 heures, remplissez le puits restant avec 1,4 ml de milieu complet.
• Changez le milieu de culture tous les 2 jours jusqu'à la fin de la culture.
• Les cellules peuvent être récupérées du scaffold après un traitement à la trypsine 1X pendant 15 minutes.
• Nous recommandons d'utiliser plusieurs densités cellulaires au début pour optimiser le protocole de culture avant vos expériences.
• Plage de densité cellulaire recommandée : 150 000 – 500 000 cellules par scaffold.

Attachement Cellulaire

Les scaffolds 3D PETG de Copner Biotech facilitent efficacement l'attachement des cellules mammifères, tout en utilisant des concentrations cellulaires faibles. Les cellules utilisées jusqu'à présent incluent, mais ne se limitent pas à : Fibroblastes L929, Kératinocytes, Cellules HeLa, Cellules MCF-7, Cellules A549 et iPSCs.

Images de Microscopie Électronique à Balayage (SEM) de cellules L929 cultivées sur un scaffold PETG au jour 7 (50K cellules semées au jour 1). Les cellules montrent une migration réussie du centre vers la périphérie du scaffold, créant un système cellulaire équilibré et confluent dans le processus.

Notre système d'impression 3D sur mesure, associé à une technologie d'impression de haute précision, permet la création de régions spécifiques du scaffold avec une rugosité de surface optimale. Ces régions permettent aux premières cellules attachées dès le jour 1 de se développer et de migrer vers la périphérie. La migration est stimulée par des gradients d'oxygène et de nutriments discrets à travers l'interface du scaffold, formés par l'hétérogénéité dans la taille et la distribution des pores.

 Viabilité Cellulaire

Notre matériau PETG a été modifié afin d'optimiser la rugosité de la surface et, par conséquent, d'améliorer l'attachement et la prolifération des cellules. Ce matériau inerte et non cytotoxique a été confirmé comme étant sûr pour une utilisation en culture cellulaire, sans effets négatifs sur la croissance ou la fonction des cellules, facilitant ainsi votre transition de la culture cellulaire 2D à 3D.
Les échafaudages PETG 3D montrent également une rigidité et ne se dégradent pas, les rendant très conviviaux pour la culture à long terme des cellules.

Cytotoxicité (A) Libération de LDH (n=3) notée par densité optique à 490 nm (B) Intensité de fluorescence relative du test alamarBlue (n=3). La lignée cellulaire L929 à une densité de 1 x 10^4 cellules a été cultivée avec des milieux témoins, des milieux conditionnés jour 1 ou des milieux conditionnés jour 7 pendant 24h à 37°C. La Figure 13 montre (A) la libération de LDH (n=3) pour chaque condition de traitement comme noté par densité optique à 490 nm (B) Intensité de fluorescence relative du test alamarBlue (n=3) pour chaque condition de traitement. La signification statistique est déterminée par le test de Friedman ; * p < 0,05.

Prolifération Cellulaire

Notre matériau PETG favorise les événements de division cellulaire, tout en minimisant la perte de cellules, ce qui permet une expansion significative des cultures en peu de temps. Cela est particulièrement utile pour ceux qui cherchent à étudier les cellules en phase de croissance exponentielle ou à enquêter sur les événements de division cellulaire en temps réel.

Les cellules L929 ci-dessous ont montré une capacité nettement accrue à former des points d'adhésion focale allongés sur les échafaudages PETG 3D, par rapport à la culture 2D standard. L'adhésion focale aux différentes surfaces de l'échafaudage est importante pour l'initiation de divers signaux, stimulant ainsi davantage la prolifération et la différenciation des cellules (Lee et al, 2004).

(Gauche) Intensité de fluorescence relative du test alamarBlue (n=3) aux points de temps ; jour 1 et jour
7. La signification statistique est déterminée par le test t apparié ; * p < 0,05, ** p < 0,01. (Droite) Points d'adhésion focale allongés, indiquant une morphologie de fibroblastes saine en culture 3D.

Formation de Sphéroïdes

Lorsque des concentrations élevées de cellules sont utilisées et cultivées pendant une période prolongée (plus de 7 jours), les échafaudages PETG 3D favorisent la formation de cultures sphéroïdales. Les systèmes de culture sphéroïdale fournissent un environnement physico-chimique similaire à celui in vivo en facilitant les interactions cellule-cellule et cellule-matrice pour surmonter les limites des cultures traditionnelles 2D.

Le système d'échafaudage PETG 3D a des pores interconnectés dans toute la structure et est conçu pour cultiver et récolter les cultures sphéroïdales avec facilité d'utilisation. En utilisant le trou central de l'échafaudage, les utilisateurs peuvent aspirer et récolter les cultures sphéroïdales en pipettant vers le haut et vers le bas avec une force minimale. Cette méthode novatrice de culture et de récolte des sphéroïdes permet aux utilisateurs de créer des modèles sphéroïdaux 3D fiables, sans utiliser plusieurs étapes et introduire des erreurs humaines dans la manipulation des sphéroïdes.

 

Images SEM de sphéroïdes dermiques cultivés sur l'échafaudage PETG 3D. Les fibroblastes et les kératinocytes ont été cultivés pendant 7 jours, après avoir été semés à une concentration de 100K le jour 1. Les sphéroïdes ont été facilement récoltés des échafaudages par aspiration avec une pipette et ont montré moins de dommages par rapport aux méthodes de récolte à partir de systèmes d'hydrogel.

 Formation de Sphéroïdes

Lorsque des concentrations élevées de cellules sont utilisées et cultivées pendant une période prolongée (plus de 7 jours), les échafaudages PETG 3D favorisent la formation de cultures sphéroïdales. Les systèmes de culture sphéroïdale fournissent un environnement physico-chimique similaire à celui in vivo en facilitant les interactions cellule-cellule et cellule-matrice pour surmonter les limites des cultures traditionnelles 2D.

Le système d'échafaudage PETG 3D a des pores interconnectés dans toute la structure et est conçu pour cultiver et récolter les cultures sphéroïdales avec facilité d'utilisation. En utilisant le trou central de l'échafaudage, les utilisateurs peuvent aspirer et récolter les cultures sphéroïdales en pipettant vers le haut et vers le bas avec une force minimale. Cette méthode novatrice de culture et de récolte des sphéroïdes permet aux utilisateurs de créer des modèles sphéroïdaux 3D fiables, sans avoir à utiliser plusieurs étapes et introduire des erreurs humaines dans la manipulation des sphéroïdes.

 

Images SEM de sphéroïdes dermiques cultivés sur un échafaudage PETG 3D. Les fibroblastes et les kératinocytes ont été cultivés pendant 7 jours, après avoir été semés à une concentration de 100K le jour 1. Les sphéroïdes ont été facilement récoltés des échafaudages par aspiration avec une pipette et ont montré moins de dommages par rapport aux méthodes de récolte à partir de systèmes d'hydrogel.

Formation d'Organoïdes

En plus de la formation de sphéroïdes, lorsqu'ils sont utilisés en conjonction avec les facteurs de croissance appropriés, les échafaudages 3D peuvent être utilisés pour générer des corps embryonnaires précoces, et par la suite des organoïdes. Les échafaudages peuvent être utilisés pour la culture à long terme des organoïdes, grâce à leur structure robuste et leur résistance.

Figure - Les structures embryonnaires précoces (image en haut à gauche) peuvent être pipetées depuis la structure de l'échafaudage et cultivées davantage pour former des structures organoïdales plus grandes et complexes (image en haut à droite) dans des plaques à faible adhésion. Les structures cellulaires peuvent être colorées et visualisées par microscopie pendant et après la culture (image en bas à droite).

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