Protocole de qPCR avec sonde Taqman®
Ce protocole est destiné à être utilisé avec, mais sans s'y limiter avec: l'ABI PRISM ® 7000, 7700 et 7900HT, l'ABI 5700, ABI 7300 et 7500 Real-Time PCR Systems, les Stratagene Mx3000P®, Mx3005P ™ et Mx4000 ®, le Corbett Recherche Rotor-Gene ™, le Rotor-Gene Q, le MJ Research DNA Engine Opticon™, Opticon ® 2 et Chromo 4 ™ Real-Time Detector, le Eppendorf Mastercycler® ep realplex, le Roche LightCycler® 480, le Bio-Rad CFX96 et le Cepheid Smart Cycler®.
Ces kits sont parfaitement adaptés pour l'analyse de l'expression génique, le génotypage des SNP, la validation par microarrays et la validation par extinction de gènes.Réactifs :
- Matrice ADN ou ADNc
- Amorce sens
- Amorce antisens
- Sonde
- Master Mix (2X)
- Eau de qualité PCR
Protocole qPCR
Etape 1: Réaction d'installation de la qPCR
- Avant la préparation des réactions de qPCR reactions, bien mélanger l'ADN matrice, les amorces et les sondes.
- Calculer les volumes requis de chaque composant selon le tableau suivant:
| Final Concentration | 20μl rxn | |
| PCR grade water up to 20μl | As required | |
| qPCR Master Mix (2X) | 1X | 10μl |
| Forward Primer (10μM) | 100 - 400 nM | Variable |
| Reverse Primer (10μM) | 100 - 400 nM | Variable |
| Probe | 100 - 500 nM | Variable |
| Template DNA or cDNA | <250 ng | Variable |
Etape 2: Configuration de la plaque
- La préparation du cocktail de réaction est vital pour la qPCR afin de réduire l'effet des erreurs de pipettages entre les échantillons. Assembler tous les éléments ci-dessous à l'exception de la matrice d'ADN ou ADNc.
- Mélanger délicatement tous les composants du cocktail avant de transférer le volume de mélange réactionnel approprié dans chaque tube/plaque de PCR.
- Ajouter la matrice ADN ou ADNc à chaque réaction.
- Les volumes de réaction peuvent être réduits de 20μl à 10μl si des tubes/plaques de faible volume sont utilisés.
- Couvrir ou sceller le tube/ la plaque de réaction et centrifuger brièvement.
Etape 3: Exécution de la réaction qPCR
- Si possible, sélectionner le mode rapide sur l'instrument.
- Programmer le protocole suivant:
- Activation enzymatique à 95 °C pendant 20 sec - 3 min (1 cycle)
- Dénaturer à 95 °C pendant 1 - 3 sec
- Appariement/Elongation/Acquisition à 60 ºC moins de 20 sec
Etape 4: Analyse des résultats
- L'analyse des données varie en fonction de l'instrument utilisé. Se référer à votre guide de l'utilisateur de l'instrument.
Liste de produits
Protocole KAPA™ PROBE FAST qPCR Kit Master Mix (2X) Universal