Optimisation des essais de cicatrisation et de migration cellulaire
Optimisation de la configuration expérimentale des essais de cicatrisation et de migration cellulaire
Introduction
Les études sur la cicatrisation des plaies et la migration cellulaire constituent la pierre angulaire de l'élucidation des systèmes complexes dans le domaine de la santé et de la maladie. Ces essais constituent un outil simple mais puissant pour étudier la cinétique de la migration cellulaire. L'étape initiale consiste généralement à créer une brèche dans une couche cellulaire confluente. Par exemple, un espace peut être créé en cultivant des cellules sur des surfaces de croissance voisines séparées par une barrière. Ensuite, le suivi de la fermeture de cet espace par imagerie time-lapse permet d'obtenir des données précieuses sur le mouvement des cellules. Cette approche permet aux chercheurs d'examiner les effets de gènes spécifiques, de conditions physiologiques ou d'agents pharmaceutiques sur des paramètres clés de la migration tels que la vitesse, la direction et la fermeture globale de l'espace. L'obtention de résultats précis et fiables passe par un dispositif expérimental bien conçu. Cette note d'application offre une vue d'ensemble des paramètres d'essai cruciaux et des lignes directrices pour la planification d'essais efficaces de cicatrisation et de migration cellulaire.
| ibidi propose différentes solutions pour les essais de cicatrisation: • Culture-Insert 2 puits dans µ-Dish 35 mm, haut et µ-Dish 35 mm, low • Culture-Insert 2 puits dans µ-Plate 24 Well • Culture-Insert 3 puits dans µ-Dish 35 mm, high • Culture-Insert 4 puits dans µ-Dish 35 mm, high • Culture-Inserts pour auto-insertion en format 2 puits, 3 puits, ou 4 puits. |
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Vous trouverez des instructions expérimentales plus détaillées dans : Note d'application 36 : "Essai de cicatrisation utilisant le Culture-Insert 2 puits dans une µ-Plate 24 puits" (PDF) |
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1 Planification de l'expérience
Avant de commencer les expériences de cicatrisation et de migration cellulaire, il convient de déterminer de manière empirique la configuration optimale de l'expérience. Le système choisi doit correspondre étroitement à vos objectifs de recherche et permettre une collecte de données réalisable. Les facteurs clés à prendre en compte seront examinés dans les chapitres suivants.
1.1 Type de cellules et nombre de passages
La sélection du type cellulaire optimal est cruciale dans les expériences de cicatrisation des plaies, guidée par l'objectif de la recherche. Les choix vont des cellules primaires, qui reproduisent les conditions in vivo mais sont difficiles à cultiver, aux lignées cellulaires plus faciles à manipuler mais qui peuvent présenter des comportements altérés. La culture répétée peut entraîner des changements dans les cellules, affectant les résultats expérimentaux clés, tels que la vitesse de migration et la réponse aux stimuli. La cohérence du nombre de passages est essentielle pour obtenir des données fiables et interprétables, car les cellules à passage élevé présentent souvent une croissance plus lente et une mortalité accrue, ce qui complique les résultats.
1.2 Densité cellulaire lors de la création de la brèche
Dans les essais de cicatrisation, il est crucial d'établir une couche cellulaire confluente adaptée à la création d'un espace pour étudier la migration cellulaire. Bien que la densité doive être suffisante pour former cette couche confluente, des cultures trop denses pourraient entraîner des problèmes, tels qu'une altération du comportement cellulaire ou le détachement de plaques de la couche cellulaire lors de la création de la brèche. Par conséquent, l'objectif n'est pas seulement d'atteindre un état confluent, mais de le faire à une densité qui permette un comportement cellulaire sain et des résultats expérimentaux précis. En outre, les chercheurs utilisent souvent une faible dose de mitomycine C (10 μg/mL), un agent de réticulation de l'ADN, qui inhibe la prolifération, ce qui permet de se concentrer plus précisément sur la migration. Nous recommandons d'utiliser une densité cellulaire qui se traduit par une couche de cellules confluentes 24 h après l'ensemencement des cellules. Selon votre type de cellule, ajoutez une concentration d'ensemencement de 3-7 × 105 cellules/ml lorsque vous utilisez des Culture-Inserts ibidi.
1.3 Contrôles positifs et négatifs
L'incorporation de contrôles est cruciale pour obtenir des résultats significatifs et fiables dans les expériences de migration cellulaire. Un contrôle positif, tel qu'un milieu contenant du facteur de croissance épidermique (EGF), doit être utilisé pour stimuler la migration cellulaire et établir une valeur de référence pour la réponse à vos substances bioactives. Un contrôle négatif, généralement un milieu sans composés bioactifs, est nécessaire pour déterminer la migration de base de votre culture cellulaire. Des réplicats techniques doivent toujours être inclus pour compenser la variabilité des conditions expérimentales. Les réplicats biologiques, qui utilisent idéalement des populations cellulaires distinctes provenant de différents individus, compensent les effets de lot et la variabilité biologique inhérente. Remarque : la division d'une culture cellulaire unique en plusieurs aliquotes ne crée pas de véritables réplicats biologiques, car ces cellules ne sont pas indépendantes et partagent une histoire commune. L'utilisation de populations cellulaires distinctes garantit la robustesse statistique et renforce la fiabilité de vos données.
1.4 Composition du milieu
Le milieu de culture cellulaire est essentiel dans les essais de cicatrisation, car il fournit des nutriments clés et influence le comportement des cellules. Le choix d'un milieu optimal garantit la santé des cellules et une représentation précise du processus biologique. Des facteurs tels que la concentration en facteurs de croissance et la teneur en sérum sont cruciaux dans cette sélection. Pour étudier efficacement les composés bioactifs dans les essais de cicatrisation, il est nécessaire d'établir leurs concentrations idéales. La meilleure façon de trouver ces concentrations est d'établir une courbe dose-réponse, qui permet de trouver un équilibre entre la réponse cellulaire souhaitée et l'évitement de la cytotoxicité. Il convient tout d'abord d'examiner la littérature existante ou les recommandations du fabricant du composé. Ensuite, la concentration doit être optimisée en fonction de la façon dont elle affecte la morphologie, le mouvement et la survie des cellules.
1.5 Méthode de création d'un espace vide
La méthode de création d'un espace sans cellules est un facteur crucial dans les essais de cicatrisation, car elle influence directement le comportement cellulaire et la reproductibilité des données expérimentales. Les techniques traditionnelles comprennent le grattage mécanique à l'aide d'une pointe de pipette ("essai de grattage") et la brûlure de la plaie à l'aide d'électrodes. L'un des avantages de ces méthodes est qu'elles génèrent des motifs moléculaires associés aux lésions (DAMP) à partir des cellules endommagées, créant ainsi un environnement similaire à celui d'une plaie in vivo. Cependant, ces techniques, en particulier la méthode du grattage, donnent souvent lieu à des lacunes de taille irrégulière et à des lésions de la couche cellulaire, ce qui complique l'interprétation des données. En revanche, les Culture-Inserts ibidi offrent de multiples avantages pour des expériences reproductibles. Ils permettent de définir avec précision un espace sans cellule de 500 µm, garantissant l'absence de fuite pendant la culture et ne laissant aucun matériau résiduel après le retrait. Ces caractéristiques contribuent à l'obtention de données très cohérentes et fiables, ce qui rend les Culture-Inserts idéaux pour les applications à haut débit. Leur conception offre la possibilité d'ensemencer différents types de cellules dans chaque puits, ce qui permet de réaliser des études comparatives sur le comportement invasif. En outre, les Culture-Inserts ibidi minimisent la génération de motifs moléculaires associés aux dommages (DAMP) provenant des cellules endommagées. Il est donc possible d'analyser l'influence des DAMPs sur le comportement migratoire.
1.6 Imagerie
L'imagerie joue un rôle essentiel dans les essais de cicatrisation, car elle permet l'observation détaillée et l'analyse de la migration cellulaire en temps réel. Pendant l'imagerie, un environnement stable et physiologique doit être maintenu pour assurer un comportement naturel des cellules, ce qui peut être réalisé grâce aux systèmes d'incubation ibidi Stage Top. Ces systèmes garantissent que les cellules sont maintenues dans des conditions optimales pendant toute la durée de l'essai de cicatrisation, ce qui facilite le suivi continu de la même position de la fente tout au long de l'expérience - un facteur essentiel pour une analyse précise. Un faible grossissement est suffisant pour la plupart des expériences de cicatrisation et de migration cellulaire. Il est important d'observer le champ de vision le plus large possible pour obtenir le maximum d'informations. Nous recommandons d'utiliser des objectifs 4x à 10x pour les expériences avec les Culture-Inserts ibidi. Il est essentiel de commencer à surveiller les cellules immédiatement après la création de la fente, en utilisant généralement la microscopie à contraste de phase pour visualiser la dynamique cellulaire sans avoir besoin de coloration. Pour une analyse solide, les images de la fente doivent être capturées à intervalles réguliers (par exemple, à des intervalles de 30 minutes après l'enroulement). Il est généralement suffisant de surveiller la fermeture de la fente pendant 24 heures. Si la microscopie à fluorescence est utilisée, il est recommandé de vérifier la phototoxicité à l'aide d'expériences de contrôle.
2 Considérations relatives à l'acquisition des données
2.1 Paramètres de sortie des essais de cicatrisation et de migration cellulaire
Dans les essais de cicatrisation, la largeur initiale de la brèche est mesurée immédiatement après la création de la brèche, ce qui permet d'établir une base de comparaison. Les mesures de la zone couverte de cellules (alternativement : zone de couverture de la surface) sont ensuite effectuées à intervalles réguliers pour surveiller la réduction de la largeur de la brèche. Le principal paramètre de sortie est le taux de fermeture de la brèche (autres noms : par exemple, vitesse de cicatrisation, taux de couverture de la brèche, taux de fermeture de la brèche), qui peut être quantifié à la fois en pourcentage de la brèche initiale fermée et en valeurs absolues (µm² ou pixels) au fil du temps. L'utilisation d'un logiciel d'analyse d'images, tel que ImageJ, améliore la précision et l'efficacité de ces mesures.
2.2 Choix des points temporels optimaux pour l'analyse
Avant de procéder à l'analyse des images et à la quantification qui s'ensuit, il est essentiel de comprendre la courbe typique de fermeture de la brèche dans les expériences de cicatrisation et de migration cellulaire. Lors de la création de la brèche, les cellules peuvent présenter une phase de retard avant que la migration ne commence, bien que cette phase puisse être brève ou absente, menant directement à la phase linéaire. La phase linéaire, au cours de laquelle le taux de fermeture de la brèche reste constant, est cruciale pour la collecte des données et constitue la phase la plus significative de l'essai. Lorsque les cellules approchent de la confluence, le taux de fermeture des espaces diminue, ce qui fait entrer les cellules dans la phase de saturation.
Tracé visualisant une couverture de surface différentielle typique. Les zones bleues indiquent un changement inhibé de la couverture de la surface, et la zone rouge indique la phase linéaire de la couverture différentielle de la surface.
2.2.1 Mesure en deux points
La méthode la plus simple pour suivre la migration est la mesure en deux points, la première image étant prise immédiatement après la formation de la fente (point de départ) et la seconde (point final) après un intervalle prédéterminé. Le point final doit se situer dans la phase de fermeture linéaire de la fente pour garantir la précision de la mesure. La détermination du deuxième point temporel nécessite un test préliminaire qui doit être effectué dans des conditions optimales afin de déterminer la durée de la phase linéaire. Idéalement, le point final devrait se situer juste avant que la courbe n'atteigne la phase de saturation, où le taux de fermeture de la fente commence à diminuer.
Tracé visualisant une couverture de surface différentielle typique avec (1) le point de départ et (2) le point d'arrivée de la mesure en deux points.
2.2.2 Mesure en dix points (ou plus)
Pour une analyse plus détaillée, la capture de dix images ou plus tout au long de l'essai peut fournir une vue d'ensemble de la courbe de migration. Cette méthode dévoile des aspects plus subtils des traitements, tels que les variations de la pente de la phase linéaire, les changements dans la durée de la phase de latence ou le moment précis de la fermeture de la fente. La détermination exacte de la phase linéaire permet de calculer la vitesse du front cellulaire.
Veuillez vous référer à la note d'application 67 : "Data Analysis of Wound Healing and Cell Migration Assays" (PDF) pour plus d'informations sur le calcul du taux de fermeture de l'espace et de la vitesse du front cellulaire.
Tracé visualisant une couverture de surface différentielle typique avec (1) le point de départ et (2-49) les autres points temporels de la mesure multipoints.