Experimental Protocol for Western Blotting

 

Séparation des protéines par électrophorèse sur gel

Avant le Western blot, les protéines d'un échantillon doivent être séparées en fonction de leur taille. Généralement, cette séparation est réalisée par SDS-PAGE (Sodium Dodecyl-Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis), où la concentration de polyacrylamide et le système de tampon influencent la mobilité des protéines à travers le gel en fonction de leur poids moléculaire. Le gel de SDS-PAGE comporte deux couches distinctes, appelées gel « d'empilement » (couche supérieure) et gel « de séparation » ou « de résolution » (couche inférieure).

Comme le montre le tableau ci-dessous, la concentration du gel de résolution doit correspondre à la taille de la protéine cible.

Taille de la protéine (kDa)	Concentration de polyacrylamide
≥500	5%
25-200	8%
15-100	10%
10-70	12.5%
12-45	15%
4-40	20%

Les gels SDS-PAGE peuvent être achetés ou facilement fabriqués en interne. Une recette courante pour la fabrication d'un gel SDS-PAGE est la suivante. Si vous utilisez un gel pré-fabriqué, passez à la section suivante.

Réactifs	6% Gel d'empilement	10% Gel de séparation
ddH2O	2 mL	3 mL
1 M Tris-HCl	400 uL pH 6.7	2.1 mL pH 8.9
30% Acrylamide/Bis- Acrylamide	600 uL	2.8 mL
10% SDS	36 uL	80 uL
10% APS (Persulfate d'ammonium)	24 uL	50 uL
TEMED (TétraMéthylÉthylèneDiamine)	4 uL	6 uL

1. Assembler le kit de coulée de gel conformément aux instructions du fabricant. Il s'agit notamment d'insérer les plaques de verre dans le cadre de coulée et de les verrouiller en place.
2. Insérer le cadre de coulée dans le support de coulée. Placez le peigne de manière appropriée.
3. A l'aide d'un marqueur, marquer le verre ~ 1cm sous le peigne. Cela indique le niveau de gel de séparation nécessaire.
4. Retirer le peigne. A l'aide d'une pipette, ajouter une petite quantité d'eau dans la chambre de gel pour s'assurer qu'il n'y a pas de fuite. Retirez l'eau à l'aide d'une lingette KimWipe.
5. Mélanger tous les ingrédients du gel de séparation, en veillant à ajouter TEMED en dernier.
6. Pipettez le gel de séparation dans la chambre, jusqu'à votre marqueur.
7. Pour éliminer les bulles, pipeter doucement une petite quantité d'alcool isopropylique (IPS) sur le dessus du gel. Laissez le gel prendre pendant 30 minutes.
8. Retirez l'IPA en insérant délicatement une lingette KimWipe dans la chambre.
9. Mélanger tous les ingrédients du gel d'empilage, en veillant à ajouter le TEMED en dernier.
10. Introduisez à la pipette le gel d'empilage dans la chambre, jusqu'au sommet de la plaque de verre.
11. Insérez votre peigne. Laissez le gel prendre pendant encore 30 minutes.

 

Préparation d'échantillon

Les protéines sont généralement extraites des cellules ou des tissus à l'aide de divers tampons d'extraction contenant des détergents, des sels et des inhibiteurs de protéase afin de préserver l'intégrité et la stabilité des protéines.

La quantité de protéines présentes dans l'échantillon est estimée par les méthodes suivantes :

1. Méthode directe basée sur l'absorption à 280 nm par spectroscopie UV.
2. Essai protéique Bradford (Calculateur d'essai Bradford)
3. Essai de quantification des protéines BCA (kits Amplite® Colorimetric ou Amplite® Fluorimetric ou Portelite™ Fluorimetric Assay).

Pour dénaturer les protéines et perturber les interactions non covalentes, un agent réducteur tel que le β-mercaptoéthanol ou le dithiothréitol (DTT) est ajouté au tampon de l'échantillon. En outre, le chauffage des échantillons à environ 95°C pendant 5 minutes ou à 70°C pendant 10 minutes permet de dénaturer complètement les protéines. Un colorant de charge est ajouté aux échantillons de protéines pour augmenter leur densité, fournir une couleur pour la visualisation et suivre la migration des échantillons pendant l'électrophorèse. Le colorant contient généralement un colorant de suivi (par exemple, le bleu de bromophénol ou le xylène cyanol) et un agent dense (par exemple, le glycérol) pour aider les échantillons à s'enfoncer dans les puits.

Électrophorèse sur gel

Matériel nécessaire :

• Chambre d'électrophorèse et blocs d'alimentation
• Micropipette

Réactifs nécessaires :

• Gel SDS-PAGE
• Tampon d'exécution 1X (Recette pour le tampon d'exécution 10X)
• Échantillons de protéines
• Échelle de protéines (PageTell™ Prestained 10-250 kDa Ladder ou ProLite™ 5-245 kD Protein Ladder)

 

1. Insérer la cassette de gel dans la chambre d'électrode. Placer la chambre d'électrodes dans la cuve d'électrophorèse.
2. Retirer le peigne du gel.
3. Ajouter ~200 ml de tampon de fonctionnement 1x dans la chambre d'électrode intérieure.
4. Remplir la chambre extérieure de la cuve jusqu'au repère indicateur présent à l'extérieur de la cuve. S'assurer que le tampon de fonctionnement recouvre complètement le gel.
5. Chauffer les échantillons dans un bain-marie à 95°C pendant 5 minutes ou à 70°C pendant 10 minutes.
6. Ajouter les échantillons et les échelles de protéines dans les puits identifiés. Le volume dépend de l'échantillon, mais se situe généralement entre 5 et 15 uL par puits. Le volume de chaque voie doit être égal en utilisant du ddH20 ou du tampon de lyse.
7. Connectez la cuve d'électrophorèse à votre alimentation électrique, le rouge (+) au rouge, le noir (-) au noir.
8. Faites fonctionner votre gel à la tension et pendant la durée souhaitées. En général, ces paramètres sont de 100 à 150 V pendant 40 à 60 minutes.

La protéine séparée sur le gel peut être colorée avec ProLite™ Orange Protein Gel Stain pour visualiser la protéine totale présente sur le gel.

Électrotransfert

Ensuite, les protéines séparées présentes sur le gel sont transférées sur une membrane par un processus appelé électrotransfert (ou électroblotting).

Matériel nécessaire :

• Appareil de transfert
• Éponge ou mousse, coupée à la même dimension que le gel
• 6 papiers filtres, coupés à la même dimension que le gel
• Plateau d'assemblage ou cassette de blotting

Réactifs nécessaires :

• Glace
• Méthanol
• Membrane PVDF (fluorure de polyvinylidène) ou Nitrocellulose, coupée aux mêmes dimensions que le gel
• Tampon de transfert 1X (Recette pour le tampon de transfert 20X)

 

1. Mouiller l'éponge, les papiers filtres et la membrane avec du méthanol.
2. Retirer avec précaution le gel de la cassette de gel.
3. Assembler soigneusement un sandwich d'électro-transfert en l'empilant dans l'ordre suivant :

   • (a) Assemblage du fond du plateau

   • (b) Éponge de pression

   • (c) Papiers filtre

   • (d) Gel

   • (e) Membrane PVDF

   • (f) Papiers filtre

   • (g) Assemblage du plateau supérieur

4. S'assurer qu'il n'y a pas de bulles d'air dans le sandwich. Presser délicatement le liquide excédentaire.
5. Placer le sandwich dans la cuve d'électrolyse, sur de la glace.
6. Ajouter le tampon de transfert à la cuve d'électro-blotting, en recouvrant complètement le sandwich.
7. Connectez le bac d'électrolyse à votre alimentation électrique, le rouge (+) au rouge, le noir (-) au noir.
8. Faire fonctionner le système d'électro-blotting pendant la durée souhaitée, qui se situe entre 45 et 90 minutes.

 

 

Blocage

Une étape de blocage empêche les anticorps de se lier de manière non spécifique à la membrane. Le blocage élimine le bruit de fond potentiel de la membrane, ce qui simplifie l'analyse des protéines. Les bloqueurs couramment utilisés sont 2 à 5 % de BSA ou de lait sec non gras dans une solution saline tamponnée (TBS ou PBS).

Tableau 1. Comparaison des tampons de blocage pour le western blotting.

Tampon de blocage	Avantages	Considérations
Lait écrémé	Peu coûteux Contient plusieurs types de protéines	Contient de la biotine et des phosphoprotéines, qui peuvent interférer avec les stratégies de détection streptavidine-biotine et la détection des protéines cibles phosphorylées. En raison du nombre de protéines présentes dans le lait, celui-ci peut masquer certains antigènes et abaisser la limite de détection du Western Blot.
Protéines purifiées	Les tampons bloquants mono-protéiques peuvent réduire les risques de réaction croisée avec les composants de l'essai par rapport aux solutions de sérum ou de lait. Idéal lorsque des bloqueurs, tels que le lait écrémé, bloquent la liaison antigène-anticorps.	Plus cher que les préparations traditionnelles à base de lait écrémé.
Sérum-albumine bovine (BSA)	Bonne alternative au lait Peut être utilisé dans les systèmes biotine-streptavidine ou lors de la recherche de phosphoprotéines	Différentes qualités de BSA sont disponibles dans le commerce et peuvent avoir un impact sur le rapport signal/bruit. La BSA est généralement un blicker plus faible, ce qui peut entraîner une plus grande liaison non spécifique de l'anticorps, mais peut augmenter la sensibilité de détection pour les protéines peu abondantes.

 

Incubation des anticorps primaires et secondaires

La protéine d'intérêt dans un Western blot peut être détectée en utilisant soit un anticorps primaire marqué, soit un anticorps primaire non marqué + un anticorps secondaire marqué.

1. Ajouter l'anticorps primaire dans 5% de BSA (sérum-albumine bovine) à la membrane.
2. Incuber la membrane pendant une nuit à 4°C sur un agitateur ou pendant 1 heure à température ambiante.
3. Si vous utilisez un anticorps secondaire, lavez la membrane trois fois avec du TBST. Incuber la membrane avec l'anticorps secondaire pendant 1 heure à température ambiante.
4. Laver la membrane trois fois avec du TBST.

Détection

Dans le cadre du Western blotting, des méthodes de détection sont utilisées pour visualiser et quantifier la présence de protéines spécifiques qui ont été transférées du gel à la membrane. Plusieurs méthodes de détection peuvent être employées, en fonction des exigences spécifiques de l'expérience et du type de marqueur présent dans votre anticorps de détection.

Voici quelques méthodes de détection couramment utilisées pour le Western blotting :

Chemiluminescence

Les substrats chimiluminescents tels que le substrat Amplite® West ECL HRP génèrent de la lumière lors de la réaction enzymatique avec la peroxydase de raifort (HRP) ou la phosphatase alcaline (AP), qui sont conjuguées à des anticorps secondaires. Il s'agit d'une méthode sensible qui produit un signal durable.

Fluorescence

Les anticorps secondaires marqués par fluorescence se lient directement aux anticorps primaires, ou les anticorps primaires sont détectés à l'aide d'anticorps secondaires conjugués à un fluorophore. Cette approche permet des capacités de multiplexage, une sensibilité élevée et une compatibilité avec divers systèmes d'imagerie.

Le guide de sélection des anticorps et du marquage des protéines peut être utile pour planifier le Western blotting et d'autres immunodosages en fournissant des informations sur le choix des anticorps les plus appropriés pour des besoins expérimentaux spécifiques.

Détection colorimétrique
Les substrats enzymatiques produisent un produit coloré lorsqu'ils réagissent avec de l'HRP ou de l'AP conjugué à des anticorps secondaires qui peuvent être utilisés pour visualiser les protéines dans les western blot.

Analyse

Dans l'analyse Western blot, des images claires du blot sont prises à l'aide d'un équipement spécialisé. L'intensité des bandes peut être quantifiée à l'aide d'un logiciel d'analyse d'images, souvent normalisée par rapport à des contrôles internes pour permettre des comparaisons précises. Les tests statistiques évaluent les différences entre les échantillons analysés, ce qui permet de tirer des conclusions significatives.

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