Culture et détachement des cellules adhérentes dans le µ-Slide VI 0.4

Introduction

Le µ-Slide VI 0.4 d'ibidi est un outil polyvalent en culture cellulaire et en microscopie, reconnu pour sa capacité à assurer une répartition homogène des cellules à travers ses six canaux. Cette lame est particulièrement efficace pour les tests d'immunofluorescence et d'imagerie de cellules vivantes, ce qui en fait un atout inestimable pour la visualisation détaillée de structures cellulaires telles que le cytosquelette d'actine et les mitochondries. Sa conception à faible volume facilite les expériences rentables avec des quantités minimales de cellules et de réactifs, et est compatible avec les conditions statiques et de flux. Ce protocole se concentre sur la technique de manipulation optimale du µ-Slide VI 0.4 lors du semis des cellules, de l'échange de milieu et de la division des cellules adhérentes HT-1080, adaptée aux caractéristiques uniques de la lame. Ce protocole utilise l'Accutase pour détacher les cellules. Cependant, selon vos besoins expérimentaux, vous pouvez également utiliser de la trypsine à la place.

Pour en savoir plus sur les avantages de l'utilisation de la µ-Slide VI 0.4, consultez la note d'application "Cell Culture in ibidi Channel Slides" (PDF).

1 Matériaux
1.1 Réactifs et tampons

- Cellules HT-1080 (85111505, Sigma Aldrich)
- Milieu de culture cellulaire : DMEM (D6546, Sigma Aldrich) avec 10% de sérum bovin fœtal
(F1283, Sigma Aldrich)
- D-PBS (14190144, Gibco)
- Accutase (A1110501, Gibco)

1.2 Equipment

- µ-Slide VI 0.4 ibiTreat (80606, ibidi)
- Rack µ-Slide (80003, ibidi)
- Equipement standard de culture cellulaire (pipettes, table de travail stérile, incubateur de culture cellulaire, flacons de culture, hémocytomètre, etc,
flacons de culture, hémocytomètre, etc.)
- Microscope à contraste de phase

2 Méthodes
2.1 Semis de cellules

Veuillez lire les instructions avant de travailler avec le µ-Slide VI 0.4.Effectuez toutes les étapes dans des conditions stériles. Il est recommandé de placer le µ-Slide VI 0.4 et le milieu de culture cellulaire dans l'incubateur la veille du semis des cellules pour éviter la formation de bulles d'air pendant la manipulation. Avant de commencer l'expérience, préparez les cellules HT-1080 dans un flacon de culture cellulaire standard (par exemple, T75) avec des cellules adhérentes au fond. Les cellules devraient idéalement être sub-confluentes et en bonne santé le jour de l'expérience.
Il est essentiel de travailler rapidement pendant toute la procédure pour éviter que les cellules ne sèchent. Sauf indication contraire, tous les volumes donnés sont par canal. 

• Ajoutez 10 ml d'Accutase au flacon T75 pour détacher les cellules ; incubez pendant 5 minutes dans l'incubateur (37°C, 5% CO2).
• Arrêtez la réaction de l'Accutase en ajoutant un volume égal de milieu de culture cellulaire.
• Récoltez la suspension cellulaire, centrifugez-la et diluez-la dans une faible quantité de milieu de culture cellulaire pour le dénombrement.
• Comptez les cellules et ajustez-les à une concentration finale de 3 × 105 cellules/ml dans du milieu de culture cellulaire.
• Déballez un ibidi µ-Slide VI 0.4 et placez-le sur un support pour µ-Slide ou une surface appropriée.
• Pipetez 30 µl de la suspension de cellules HT-1080 directement dans chaque canal. Un dispensage rapide en pointant la pointe vers le canal lors du remplissage aide à éviter les bulles d'air piégées. Éliminez toute bulle d'air piégée du canal en inclinant le µ-Slide et en tapotant un bord.
• Couvrez les réservoirs avec le couvercle fourni.
• Placez le µ-Slide avec le support dans l'incubateur (37°C, 5% CO2) et laissez les cellules s'attacher pendant 1 heure.
• Remplissez 60 µl de milieu de culture cellulaire dans chaque réservoir. Ne piègez pas de bulles d'air.
• Placez le µ-Slide avec le support dans l'incubateur (37°C, 5% CO2) et incubez les cellules toute la nuit.
• Pour une culture cellulaire prolongée, nous recommandons un échange continu du milieu tous les deux jours (voir Chapitre 2.2).

2.2 Échange continu de milieu de culture

• Aspirez soigneusement le milieu de la solution depuis les réservoirs. N'aspirez aucun liquide directement depuis le canal lui-même. Orienter l'embout loin du canal peut aider.
• Introduisez doucement 120 µl de milieu de culture cellulaire dans un réservoir, en renouvelant le milieu du canal.
• Aspirez le vieux milieu de culture cellulaire du réservoir opposé. Faites attention lorsque vous utilisez un dispositif d'aspiration de culture cellulaire, car cela peut entraîner l'élimination de cellules partiellement attachées ou de grappes. Orienter l'embout loin du canal peut aider.
• Rechargez les réservoirs en utilisant 60 µl de milieu de culture cellulaire par réservoir.

2.2 Échange continu du milieu de culture

• Retirez délicatement le milieu des réservoirs sans aspirer de liquide du canal lui-même. Orienter la pointe loin du canal peut aider dans ce processus.
• Ajoutez doucement 120 µl de milieu de culture cellulaire dans un réservoir pour recharger le canal.
• Aspirez le vieux milieu de culture cellulaire du réservoir opposé. Faites preuve de prudence lors de l'utilisation d'un dispositif d'aspiration de culture cellulaire pour éviter de déloger des cellules ou des agrégats partiellement attachés. Orienter la pointe loin du canal peut aider à prévenir cela.
• Remplissez chaque réservoir avec 60 µl de milieu de culture cellulaire.

2.3 Détachement des cellules

• Remplacez soigneusement le milieu de culture cellulaire par du D-PBS à travers un échange continu de milieu pour le lavage.
• Aspirez soigneusement l'ensemble du volume du canal.
• Remplissez immédiatement le canal avec 30 µl d'Accutase en plaçant la pointe de la pipette directement à l'entrée du canal.
• Incubez les cellules pendant 5 minutes à 37°C.
• Vérifiez le détachement des cellules à l'aide d'un microscope en contraste de phase. Le détachement des cellules peut être reconnu par un arrondi des cellules ; si les cellules sont toujours attachées, continuez l'incubation pendant quelques minutes supplémentaires.
• Rincez chaque canal avec 100 µl de milieu de culture cellulaire pour arrêter le détachement des cellules.
• Aspirez la suspension cellulaire du réservoir opposé ; s'il reste des cellules, répétez l'étape de rinçage.
• Centrifugez la suspension cellulaire, éliminez le surnageant et procédez aux étapes suivantes.