Protocole pour la cytométrie en flux sur tissus

I. Matériels requis
Réactifs
- Un (ou plusieurs) anticorps primaire couplé(s) ou non et spécifiques de votre(s) molécule(s) d'intérêt
- Un bloqueur des récepteurs Fc ou « Anti-CD16/32, block Fc binding » qui fixe l'anticorps primaire de façon aspécifique
- Un Anticorps secondaires, dans le cas de marquages indirects avec un Ac primaire non couplé
- Un (ou plusieurs) isotypes contrôles non relevant(s) d'isotypes et de couplages identiques à ceux des anticorps primaires

Tampons
- Un tampon de marquage en cytométrie de flux (Réf « Staining Buffer »: 00-4222)
- Tampon de lyse des globules rouges (Réf « RBC Lysis buffer » : 00-4333-57) en présence de sang
- Bleu trypan pour le comptage des cellules (Réf « Trypan blue » : 1209-10)
- Liquide de gaines pour le cytomètre de flux

Matériel
- Des pipettes et un Pipet-aid
- Une centrifugeuse
- Un réfrigérateur ou de la glace
- Un cytomètre de flux


II. Durée de l'expérimentation
- 30 mn de préparation des cellules
- 30 mn de préparation des échantillons et de l'anticorps (dilutions)
- 30 mn à 1 h d'incubation des anticorps selon la stratégie utilisée (marquage direct ou indirect)
- 30 mn à 1 h de lecture des cellules par le cytomètre de flux (selon nombre d'échantillons, concentration des cellules et les réglages du cytomètre)
- TOTAL : 2 à 3 heures


III. Mode opératoire
Préparation des cellules
- Broyer le tissu afin d'obtenir une suspension cellulaire
- Transférer le broyat dans un tube de 50 mL et laisser sédimenter les gros débris restants et les éventuels dépôts de graisse
- Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min (300 - 400g) à 4°c et enlever le surnageant
- En présence de sang, resuspendre le culot dans 3 mL de tampon de lyse pendant 10 mn à 37°c, diluer ensuite dans 10 mL de PBS et recentrifuger la suspension pendant 5 min (300 - 400g) à 4°C et enlever le surnageant
- Resuspendre le culot dans 50 mL de tampon de réaction et faire un comptage des cellules en prélevant 100 µl pour visualiser dans du bleu Trypan
- Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min (300 - 400g) à 4°c et enlever le surnageant

Facultatif :
- En cas de marquage direct, pré-incuber les cellules avec 0,5 à 1 µg / 106 cellules de bloqueur des récepteurs Fc pendant 10 mn à 4°c puis diluer le bloqueur avec 50 mL de tampon de réaction et recentrifuger les cellules pendant 5 mn (300 - 400g) à 4°c et enlever le surnageant

- Resuspendre les cellules dans un volume de tampon de réaction permettant d'obtenir une concentration finale de 2 x 107 cellules / ml

Préparation de l'anticorps et incubation avec les cellules
- Diluer l'anticorps Iaire et l'isotype contrôle dans 50 µl de tampon de réaction afin d'obtenir la concentration désirée et validée au préalable par une titration (identique pour les deux Ac)
- Incuber 50 µl de la préparation cellulaire avec 50 µl de la préparation d'anticorps Iaire ou d'isotype contrôle dans une plaque 96 puits à fond U
- Agiter délicatement la plaque et incuber pendant 15-30 mn à 4°c et à l'obscurité

Note : Les anticorps ont des affinités différentes avec leur antigène et requièrent des temps d'incubation variables à optimisés au préalable.

- Ajouter 200 µl de tampon de réaction pour arrêter la réaction
- Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min (300 - 400g) à 4°c et enlever le surnageant
- Répéter deux fois les lavages des cellules avec 200 µl de tampon de réaction

Facultatif : En cas de marquage indirect, répéter les étapes de marquage avec l'anticorps IIaire avec le même protocole et les mêmes observations

- Resuspendre dans 500 µl de tampon de réaction ou du tampon de fixation complémenté à 2%de formaldéhyde
- Lire les cellules marquées au cytomètre en flux


IV. Moteurs de recherches
- Anticorps primaires
- Anticorps secondaires, dans le cas de marquages indirects avec un Ac Iaire non couplé