Protocole de RT-PCR quantitative 1-step pour ABI Prism™
Ce protocole est destiné à être utilisé avec ABI PRISM® 7000, 7700, 7900HT, ABI 7300 Real-Time PCR Systems, GeneAmp® 5700, StepOne™, StepOnePlus™ et ViiA™ 7. Ce coffret n'est pas compatibles avec les instruments utilisant ROX à une concentration finale inférieur à 500 nM.
Protocole KAPA™ SYBR® FAST One-Step qPCR ABI Prism™
Réactifs :
- Matrice ARN
- Amorce sens
- Amorce antisens
- KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2X)
- ROX Reference Dye Low/High (50X)
- dUTP
- KAPA RT Mix (50X)
Protocole général de qPCR
Etape 1: Réaction d'installation de la qPCR
- Avant la préparation des réactions de qPCR reactions, bien mélanger l'ARN matrice, les amorces, le KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2X), le KAPA RT Mix (50X), les dUTP (10 mM) et le ROX Reference Dye High/Low.
- Conservez tous les composants coffret et assembler faire les réactions dans la glace pour éviter la synthèse prématurée de l'ADNc.
- L'apport recommandé d'ARN est de 1 pg à 100 ng d'ARN total.
- Préparer un cocktail de réaction afin de réduire les erreurs de pipetage. Distribuer des aliquots égaux dans les tubes de réaction. Ajouter l'ARN à chaque réaction comme étape finale. L'ajout de 2 à 5μl d'ARN permettra d'améliorer la précision du dosage.
- Inclure un contrôle sans matrice (NTC) et contrôle de non RT (NRT) lorsque cela est nécessaire. La NTC permettra la détection de la contamination dans les composants de la réaction. Le contrôle NRT teste l'ADN génomique contaminant dans la réaction.
- Calculer les volumes requis de chaque composant selon le tableau suivant:
| Concentration finale | 20μl rxn | |
| Eau de qualité PCR jusqu'à 20μl | Selon besoins | |
| KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2X) | 1X | 10μl |
| Amorce sens (10μM) | 200 nM | 0.4μl |
| Amorce antisens (10μM) | 200 nM | 0.4μl |
| dUTP (10 mM) (optionnel) | 200μM | 0.4μl |
| Colorant de référence ROX | Inclus dans le Master Mix à la concentration finale de 500nM | N/A |
| KAPA RT Mix (50X) | 1X | 0.4μl |
| Matrice ARN | variable | < 5μl |
Etape 2: Configuration de la plaque
- Transférer le volume approprié de mélange réactionnel dans chaque puits d'une plaque ou sans un tube de PCR. Les volumes réactionnels peuvent être réduits de 20μl à 10μl si des tubes/plaques de faible volume sont utilisés.
- Couvrir ou sceller le tube/la plaque de réaction et centrifuger brièvement.
Etape 3: Exécution de la réaction qPCR
- Si possible, sélectionner le mode rapide sur l'instrument.
- Programmer le protocole suivant:
| Etape | Température | Durée | Cycles |
| Synthèse d'ADNc | 42°C | 5 min | Conserver |
| Inactivation de la RT | 95°C | 2-5 min | Conserver |
| Dénaturation | 95°C | 3 sec | 40 |
| Hybridation/ Elongation | 60°C | ≥ 20 sec | 40 |
| Dissociation | Selon les | instructions | de l'appareil |
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