Immunohistochemie (IHC) Algemeen protocol

I. Vereist materiaal
Reagentia
- Een primair antilichaam ,al dan niet gelabeld, tegen de doelmolecule
- Openbaring kit
- Chromogen

Buffers
- Xyleen
- Alkoholische baden van 70%, 80% en 95%
- Waterstofperoxide (H2O2)
- Tris EDTA, Tris HCl
- Tween-20

Materiaal
- Pipetten en Pipet-aid
- Waterbad


II. Experimenteerlengte
- 10 mn van peroxydase blokkering
- 30 mn antigenische retrieval
- 1 uur incubatie van primair antilichaam
- 10 mn incubatie van chromogeen
- 2 uur spoelstappen en baden
- TOTAAL : 4 uur


III. Protocol
- Deparaffineer de sectie in 3 xyleenwissels, telkens 5 minuten.
- Was de sectie gedurende 5 minuten in 96%, 80% en 70% benzylalcohol.
- Spoel in gedistilleerd water.
- Blokkeer de endogene peroxidase door het weefsel gedurende 10 minuten te incuberen in 3% waterstofperoxide (H2O2).
- 5 minuten wassen in gedestilleerd water.
- Wassen in 0,05 M Tris-HCl , pH 7,6 buffer aangevuld met 0,2% Tween-20 (buffer A) gedurende 5 minuten.
- Voor geconcentreerde producten: Incubeer de sectie met primair antilichaam verdund in buffer A in de verdunning 1:100 - 200 gedurende 1 uur in de gesloten natte kamer.
Voor RTU-producten: Incubeer de sectie met primair antilichaam (klaar voor gebruik) gedurende 1 uur in een gesloten natte kamer.
- Was tweemaal 5 minuten met buffer A.
- Breng het secundaire antilichaam aan (het protocol hangt af van de leverancier), en ga over tot het standaard immunohistochemie-protocol (HRP - Peroxide - DAB).
- Tweemaal 5 minuten wassen met buffer A.
- Breng het chromogeen (DAB) aan, 10 minuten.
- Was 10 minuten in water.
- Kleur 5 minuten in hematoxyline.
- Was in water voor 10 minuten.
- Dehydrateer de sectie in 2 wisselingen van 96%benzylalcohol gedurende telkens 5 minuten.
- Was de sectie in 2 xyleenwissels gedurende telkens 2 minuten.
- Monteer de dia voor observatie.