Immunohistochemieprotocol - Avidine/Biotinemethode (ABC)
Het principe van ABC-detectiekits is gebaseerd op de affiniteit van avidine (of streptavidine) voor biotine. De afkorting ABC staat inderdaad voor Avidine/Biotine Complex.
In het algemeen bestaan de ABC-detectiekits uit:
- Een gebiotinyleerd secundair antilichaam
- Een avidine/enzymcomplex
De kits kunnen al dan niet de blokkeer- en verdunningsbuffers en het substraat bevatten, afhankelijk van de formaten.
I. Vereist materiaal
Reagentia
- A primair antilichaam , labeled or not, against the target molecule
- Openbaring kit
- Chromogen
Buffers
- Xyleen
- Alkoholische baden van 70%, 80% en 95%.
- Waterstofperoxide (H2O2)
- Tris EDTA, Tris HCl
- Tween-20
Reagentia
- A primair antilichaam , labeled or not, against the target molecule
- Openbaring kit
- Chromogen
Buffers
- Xyleen
- Alkoholische baden van 70%, 80% en 95%.
- Waterstofperoxide (H2O2)
- Tris EDTA, Tris HCl
- Tween-20
II. Experimenteer tijd
- 10 min voor peroxydase blokkering
- 30 min voor het ophalen van antigeen (indien nodig)
- 30-60 min voor incubatie met primair antilichaam
- 10 min voor inubatie met gebiotinyleerd secundair antilichaam
- 10 min voor incubatie met streptvidineperoxidaseconjugaat
- 5 min voor chromogeen
- 5 min voor chromogeen
- Hematoxyline kleuring (optioneel)
- TOTAAL : 2-3 uur
- TOTAAL : 2-3 uur
III. Protocol
- Peroxydase blockin: Breng 2 druppels (100 µl) of voldoende volume peroxydase blocking reagens (3%H2O2 oplossing) aan om de weefselsectie te bedekken en incubeer. Spoel het glaasje af met gedestilleerd water.
- HIER-voorbehandeling (zie specificatieblad antilichaam) : Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) kan nodig zijn voor primair antilichaam voorgesteld door verkoper. Wassen met PBS 2 min, 3 keer
- Pre-blocking : Voeg 2 druppels of voldoende volume Pre-blocking oplossing toe om het weefsel volledig te bedekken en incubeer. Blot off oplossing, niet spoelen.
- Primair antilichaam (geleverd door de gebruiker) : Breng 2 druppels of voldoende volume Primair antilichaam aan om de weefselsectie volledig te bedekken. Incubeer in vochtige kamer gedurende 30-60 min.
- Secundair antilichaam: Breng 2 druppels of voldoende volume primair antilichaam aan om de weefselsectie volledig te bedekken. Incubeer gedurende 10 minuten.
-HRP-Streptavidine: Breng 2 druppels of voldoende volume HRP-Streptavidine aan om de weefselsectie volledig te bedekken en incubeer 10 min. Spoel met PBS gedurende 2 min, 3 keer.
- Chromogeen : Voeg 1 druppel of 2 druppels (voor hogere gevoeligheid en contrast) chromogeen concentraat toe aan 1 ml Substrat. Goed mengen, tegen licht beschermen en binnen 5 uur gebruiken. Breng 2 druppels (100 µl) of voldoende volume voorgemengd chromogeen aan om het weefsel volledig te bedekken en incubeer 5 minuten. Spoel met gedistilleerd water gedurende 2 minuten, 3 keer.
- Hematoxyline (facultatief) : Counterstain met 2 druppels (100 µl) of meer om het weefsel volledig te bedekken en wacht ongeveer 10-20 sec. Spoel grondig onder kraanwater gedurende 1-2 min. Leg de objectglaasjes in PBS tot ze een blauwe kleur vertonen (ongeveer 30-60 sec). Spoel goed in gedestilleerd water.
- Montage : Volg de montageprocedure van de fabrikant.
Opmerkingen :
- De fixatie, de dikte van de weefseldia, de antigeenretrieval en de primaire verdunning en incubatietijd beïnvloeden de resultaten aanzienlijk. De onderzoeker moet met alle factoren rekening houden en de optimale omstandigheden bepalen bij de interpretatie van het resultaat.
- Weefselkleuring is afhankelijk van de juiste behandeling en bewerking van de weefsels vóór de kleuring. Een onjuiste weefselvoorbereiding kan leiden tot fout-negatieve of onduidelijke resultaten.
- Meng geen reagentia van verschillende partijen.
- Laat de objectglaasjes op geen enkel moment tijdens het kleuren drogen.