Protocol voor intracellulaire flowcytometrie

I. Vereist materiaal
Reagentia
- Een primair antilichaam tegen de doelmolecule
- Een secundair antilichaam bij indirecte kleuring met een niet-gelabeld primair antilichaam.
- Een niet-relevant controle-isotype met een vergelijkbaar label als het primaire antilichaam

Buffers
- Een kleuringbuffer
- Een Permeabilisatiebuffer
- Een intracellulaire fixatiebuffer

Materiaal
- Pipetten en Pipet-aid
- Centrifugator
- Vriezer
- Flow cytometer


II. Experimenteerlengte
- Stimulatie van cellen (afhankelijk van het celtype)
- 2 tot 3 uur incubatie van de antilichamen
- 30 mn tot 1 uur monsters lezen met de flowcytometer (afhankelijk van het aantal monsters, de celconcentratie en de capaciteit van de cytometer)
- TOTAAL : 3 tot 4 uur


III. Protocol
- Bereid cellen voor volgens uw celaanpassingsprotocol
- Kleur de cellen volgens de algemene protocolaanbevelingen voor cellen in suspensie.
- Na de eerste wasbeurt, fixeer de cellen met 100 µl fixatiebuffer en vortexbuizen.
- Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in een donkere kamer.
- Centrifugeer gedurende 5 mn (300 - 400g) bij 4°c
- Voeg 1 ml permeabilisatiebuffer toe
- Centrifugeer gedurende 5 mn (300 - 400g) bij 4°c
- Voeg 20 µl verdund primair antilichaam toe in een optimale concentratie (volgens de fabrikant) van 0,5 tot 0,6 µg/106 cellen in permeabilisatiebuffer en vortex.
- Incubeer de buisjes 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 1 ml permeabilisatiebuffer toe
- Centrifugeer gedurende 5 mn (300 - 400g) bij 4°c
- Resuspendeer de cellen in 500 µl assaybuffer of fixatiebuffer aangevuld met 2% formaldehyde.
- Cellen aflezen in een flowcytometer


IV. Zoekmachines
- Primaire antilichamen
- Secundaire antilichamen