onbeklede ELISA

I. Vereist materiaal

Reagentia
- Een primair antilichaam , specifiek voor het doelmolecuul
- Een tweede primair antilichaam  detectie, specifiek voor de doelmolecule
- Een recombinante molecule om als standaard te gebruiken
- Detectieoplossingen: bv. Streptavidine-HRP en TMB

Buffers
- CoatingBuffer: bv. PBS
- Blokkeerbuffer: bijv. PBS met 5%BSA
- Wasbuffer: bv. PBS met 0.05%Tween
- Verdunningsmiddel voor monster en standaard: bv.  PBS 1%BSA
- Stopoplossing: b.v. verdund H2SO4

Materiaal - microtiterplaten met 96 putjes
- Plaatdeksels/afdichtingen
- 5 ml en 10 ml pipetten met schaalverdeling
- 20 µl tot 1.000 µl instelbare eenkanaals micropipetten met wegwerptips
- 50 µl tot 300 µl verstelbare meerkanaals micropipet met wegwerptips
- Meerkanaals micropipetreservoir
- Bekers, kolven, cilinders nodig voor de bereiding van reagentia
- Inrichting voor het toedienen van wasoplossing (meerkanaals wasfles of automatisch wassysteem)
- Microtiterplaatlezer die bij 450 nm kan lezen



II. Experimentele periode
- 1 tot 2 uur etikettering
- 3 uur procedure
- 30 min van verschillende wassingen
- 10 minuten lezen
- TOTAAL : 4 tot 5 uur


III. Procedure
Coating - Verdun het capture antibody tot de juiste concentratie (volgens insert) met coatingbuffer (10 ml eindvolume per plaat).
- Voeg 100 µl van de capture antibody-oplossing toe aan alle putjes van de plaat, dek af en incubeer overnacht bij 4°C.
- Zuig de inhoud van elk putje af en was de plaat ten minste tweemaal met 400 µl wasbuffer in elk putje.

Opmerking : Na de laatste spoeling moet alle resterende buffer worden verwijderd door voorzichtig te deppen op absorberend papier.

- Voeg 250 µl blokkeeroplossing toe aan alle putjes van de plaat, dek af en incubeer 2 uur bij kamertemperatuur.
- Zuig de inhoud van elk putje af en was de plaat vervolgens ten minste twee keer met 400 µl wasbuffer in elk putje.
Analyseprocedure
- Voeg 100 µl bereide standaard-, monster- en controleverdunningen toe aan de desbetreffende wells, dek de plaat af en incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur.
- Zuig de inhoud van elk putje af en was de plaat ten minste twee keer met 400 µl wasbuffer in elk putje.
- Voeg 100 µl van het verdunde detectieantilichaam (verdund volgens insert) toe aan elk putje, dek de plaat af en incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur.
- Zuig de inhoud van elk putje af en was de plaat ten minste twee keer met 400 µl wasbuffer in elk putje.
- Voeg 100 µl van de Streptavidine-HRP-oplossing toe aan alle putjes, dek de plaat af en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Zuig de inhoud van elk putje af en was de plaat ten minste twee keer met 400 µl wasbuffer in elk putje.
- Voeg 100 µl van de TMB-oplossing toe aan alle putjes, dek de plaat af en incubeer minimaal 10 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: De incubatietijd van de substraatoplossing wordt gewoonlijk bepaald door de prestaties van het ELISA-leesapparaat. Veel ELISA-lezers registreren slechts de absorptie tot 2,0 O.D. Daarom moet de analist de kleurontwikkeling in de afzonderlijke microwells observeren en de substraatreactie stoppen voordat de positieve wells niet meer binnen het te registreren bereik vallen.

- Voeg 100 µl stopoplossing toe aan alle putjes en meet binnen 30 minuten de absorptiemetingen bij 450nm (indien beschikbaar met 620nm als referentiegolflengte is 610-650 aanvaardbaar).