Onderzoek de PhosphoSens technologie voor nauwkeurige meting van kinase- en fosfataseactiviteit
Ontdek hoe PhosphoSens® technologie een oplossing biedt voor het nauwkeurig meten van kinase- en fosfataseactiviteit, waardoor onderzoekers meer inzicht krijgen in cellulaire signalering en therapeutische ontwikkeling.
Eiwitfosforylering en defosforylering zijn fundamentele biochemische processen die cellulaire functies reguleren, zoals signaaltransductie, voortgang van de celcyclus, metabolisme en genexpressie. Deze processen worden gekatalyseerd door twee klassen van enzymen: kinasen en fosfatasen.
Eiwitkinasen zijn enzymen die een cruciale rol spelen in het reguleren van cellulaire functies (Cheng et al., 2011). Deze enzymen zijn betrokken bij processen zoals celgroei, differentiatie, metabolisme, proliferatie en geprogrammeerde celdood (Shchemelinin et al., 2006). Het menselijke genoom codeert voor 518 verschillende eiwitkinasen, waardoor ze een van de grootste enzymfamilies in het lichaam vormen (Manning et al., 2002). Vanwege hun cruciale rol in cellulaire signaaltransductie, worden verstoringen in de activiteit van kinasen in verband gebracht met veel ziekten, waaronder kanker en andere aandoeningen.
Eiwitfosfatasen zijn enzymen die een cruciale rol spelen in de cellulaire regulatie door fosfaatgroepen te verwijderen van gefosforyleerde aminozuurresiduen op eiwitten. Ze worden ingedeeld in verschillende families op basis van hun structuur en katalytische mechanismen.
Om beter te begrijpen hoe eiwitkinasen en fosfatasen werken en effectieve therapieën te ontwikkelen, is het belangrijk om hun activiteit nauwkeurig te meten. Hier komen hulpmiddelen zoals de AssayQuant’s PhosphoSens Kinase en Fosfatase Assays om de hoek kijken. Dit platform maakt een nauwkeurige en gevoelige detectie van kinase- en fosfatasenactiviteit mogelijk, wat essentieel is voor zowel basisonderzoek als therapeutische ontwikkeling.
PhosphoSens® Technologie
De kern van de PhosphoSens® technologie is gebaseerd op de Chelation-Enhanced Fluorescence (ChEF) methode. Deze methode maakt gebruik van een synthetisch aminozuur met een 8-hydroxyquinoline derivaat (sulfonamidooxine, Sox). Sox bindt zich aan magnesiumionen (Mg²⁺) en interageert met de fosforylatieplaatsen op de kinase-subbstraten.
In de niet-gefosforyleerde toestand heeft Sox een lage affiniteit voor Mg²⁺, wat resulteert in een minimale fluorescentie. Wanneer het substraat echter gefosforyleerd wordt, neemt de affiniteit van Sox voor Mg²⁺ toe, wat resulteert in een sterke fluorescentiesignaal. Deze fluorescentie kan worden gemeten met behulp van standaard fluorescentielezerplaten, waardoor het eenvoudig is om de kinaseactiviteit te kwantificeren (Figuur 1).
Figuur 1: ChEF-mechanisme voor directe eiwitkinaseactiviteitsdetectie
Figuur 2A toont de typische fluorescentie veranderingen bij fosforylatie van een PhosphoSens-peptide substraat en Figuur 2B toont de excitatie- en emissiespectra van een typisch gefosforyleerd PhosphoSens-peptide. De fluorescentie-eigenschappen van het Mg(II)-gecoördineerd met de 8-hydroxyquinoline van Sox hebben een λExMax van ~360 nm (358-363 nm) en een λEmMax van ~492 nm (485-498 nm). Aangezien het fluorescentiespectrum relatief breed is (zie Figuur 2B), kan de fluorescentie-emissie worden gemeten tussen 475-508 nm met <7% verlies in signaalintensiteit.
Figuur 2: Fluorescentiespectra van PhosphoSens Peptiden
PhosphoSens® Kinase en Fosfatase
PhosphoSens® kits, die CSox-peptide substraten bevatten, zijn compatibel met verschillende typen kinasen, zowel gezuiverd als aanwezig in complexe biologische monsters. Deze flexibiliteit maakt PhosphoSens® een uitstekende tool voor diverse onderzoeksapplicaties, van het screenen van kinase-inhibitoren tot het analyseren van de impact van kinase-mutaties.
Voor fosfatase-assays maakt PhosphoSens® gebruik van een vergelijkbare benadering met fosfo-Sox-peptiden. Deze assays zijn ook homogeen, continu en zeer gevoelig, en bieden betrouwbare gegevens voor het bestuderen van fosfatase-activiteit onder fysiologische omstandigheden.
PhosphoSens® biedt een eenvoudige maar krachtige oplossing voor het meten van de activiteit van kinasen en fosfatasen in verschillende biologische contexten. Of u nu kinase-inhibitoren onderzoekt, kinase-mutaties analyseert of de regulatie van fosfatasen bestudeert, PhosphoSens® biedt betrouwbare, efficiënte en nauwkeurige resultaten. Door het vereenvoudigen van deze complexe metingen helpt PhosphoSens® onderzoekers de geheimen van cellulaire signaaltransductie te ontrafelen en legt het de basis voor de ontwikkeling van gerichte therapieën.
Referenties
Cheng, H.C., Qi, R.Z., Paudel, H. en Zhu, H.J., 2011. Regulatie en functie van kinasen en fosfatasen. Enzyme research, 2011, p. 794089.
Shchemelinin, I., Sefc, L. en Necas, E., 2006. Kinasen: hun functie en belang in kanker en andere ziekten. Folia biologica, 52(3), p. 81.
Manning, G., Whyte, D.B., Martinez, R., Hunter, T. en Sudarsanam, S., 2002. De kinase-set van het menselijk genoom. Science, 298(5600), p. 1912-1934.