Traditionele 2D celkweekmethoden onderwerpen cellen aan een niet-fysiologische architecturale toestand. Wanneer ze in 2D gekweekt worden, nemen zoogdiercellen een bipolaire toestand aan met een basale en apicale zijde. Om deze onnatuurlijke morfologie aan te pakken, vindt cytoskeletale hermodellering plaats en wordt de daaropvolgende ultrastructuur van de cel sterk veranderd (Ravi et al., 2015). Cellen gekweekt in 2D hebben ook onbeperkte toegang tot zuurstof, voedingsstoffen en metabolieten - wat niet het geval is in hun respectievelijke weefsels in vivo. Deze beperkingen betekenen uiteindelijk dat laboratoria die testen uitvoeren op cellen in deze onnatuurlijke omgeving minder betrouwbare resultaten in vitro opleveren.

3D-celkweek creëert een 3D-architectuur voor celgroei en biedt een nauwere en fysiologisch relevante omgeving. Groei van cellen op 3D scaffolds bevordert nauwkeurige cel-naar-cel en cel-naar-extracellulaire omgeving interacties met variabele toegang tot zuurstof, voedingsstoffen en metabolieten. Zoogdiercellen die zich in een meer representatieve omgeving bevinden, die hun gastheerweefsel in vivo weerspiegelt, vertonen relevantere genexpressie, splicing topologie en biomarkers in vitro, wat op zijn beurt veel meer betrouwbaarheid biedt in termen van medicijn- en toxiciteitsmodellering in het lab (Lv et al., 2016).

Steigerontwerp

Recente studies tonen het belang aan van discrete zuurstofgradiënten in celbeweging over de steigerinterface (Ardakani et al, 2014). Cellen gekweekt op houtstapelstructuren hebben meestal een heterogene verdeling, waarbij clusters vaak voorkomen. Door een discrete zuurstofgradiënt over de interface van onze 3D PETG-steiger te introduceren, stimuleren we celproliferatie van het centrum naar de periferie. Het resultaat is een veel evenwichtiger systeem van cellen op de steiger, met confluentiepatronen zoals in in vivo weefsel.

Copner Biotech heeft op maat gemaakte 3D-modelleringssoftware en de volgende generatie 3D-printtechnieken ontwikkeld om deze complexe architecturen te maken. Ons additieve productieproces laat een hoge batch-tot-batch consistentie zien, waardoor variabelen in uw 3D celmodellen geminimaliseerd worden.

 

Validatie van de microstructuur van de steiger - (Links) Bovenaanzicht van een PETG-steiger met een standaardlichtmicroscoop. (Rechts) Dwarsdoorsnede van een PETG-steiger vastgelegd met behulp van rasterelektronenmicroscopie (SEM).

Protocollen voor sterilisatie en het zaaien van cellen

Opmerkingen voordat u begint

• Vóór gebruik moeten de scaffolds hydrofiel worden gemaakt door ze gedurende 15 minuten met 70% ethanol te wassen. De steigers moeten voor gebruik in de juiste oriëntatie worden geplaatst (zie onderstaande afbeelding). Zorg er bij het wassen met ethanol voor dat de oplossing grondig door de onderling verbonden poriën van de scaffolds wordt gepipetteerd.
• Voeg voldoende ethanol toe om de steiger volledig te bedekken, verwijder en was 2x met geschikte kweekmedia (2ml).
• Om drogen te voorkomen, laat de steiger in het laatste medium (2 ml) wassen tot nodig is.
• We raden aan om de steigers 4 uur in dit laatste medium te laten om de celhechting te verbeteren.

Juiste oriëntatie van de steiger - De steiger uiterst links geeft de juiste oriëntatie voor gebruik weer, terwijl de andere steigers ondersteboven staan. Houd er rekening mee dat de basis van de steigers er anders uit kan zien.

Cellen zaaien op steiger

• Verwijder alle celkweekmedia uit de well vóór het zaaien met een pipet.
• Pipetteer langzaam de gewenste celdichtheid via een 100ul celmediaoplossing op de bovenkant van de scaffold en zorg ervoor dat de oplossing zoveel mogelijk door de onderling verbonden poriën dringt.
• Plaats de geplaatste steigers gedurende 3 uur terug in de incubator om celaanhechting mogelijk te maken.
• Vul na de incubatie van 3 uur de resterende well met 1,4 ml volledig medium.
• Ververs het kweekmedium om de 2 dagen tot het einde van de kweek.
• Cellen kunnen worden teruggewonnen van de steiger na een 1X trypsinebehandeling gedurende 15 minuten.
• We raden aan om aanvankelijk verschillende celdichtheden te gebruiken om het kweekprotocol voorafgaand aan uw experimenten te optimaliseren.
• Aanbevolen celdichtheidbereik 150.000 - 500.000 cellen per steiger.

Cellulaire aanhechting

De 3D PETG-steigers van Copner Biotech zorgen voor een efficiënte aanhechting van zoogdiercellen, terwijl de concentraties voor celaanhechting laag zijn. Tot op heden zijn onder andere de volgende cellen gebruikt: L929 fibroblasten, keratinocyten, HeLa-cellen, MCF-7-cellen, A549-cellen en iPSC's.

SEM-beelden (Scanning Electron Microscopy) van L929 cellen gekweekt op PETG-steiger op dag 7 (50K cellen uitgezaaid op dag 1). De cellen laten een succesvolle migratie zien van het midden naar de periferie van de steiger, waarbij een evenwichtig, confluent celsysteem ontstaat.

Ons op maat gemaakte besturingssysteem voor 3D-printen, gekoppeld aan zeer nauwkeurige printtechnologie, maakt het mogelijk om specifieke regio's van de steiger te creëren met een optimale oppervlakteruwheid. Deze regio's geven aanleiding tot de eerste succesvol gehechte cellen vanaf dag 1 zaaien en fungeren als startpunt voor celproliferatie en migratie naar de periferie. Migratie wordt gestimuleerd door discrete zuurstof- en voedingsgradiënten over de scaffoldinterface, gevormd door de heterogeniteit in poriegrootte en -distributie.

Cellulaire levensvatbaarheid

Ons PETG-materiaal is aangepast om de oppervlakteruwheid te optimaliseren en vervolgens de celhechting en -proliferatie te verbeteren. Van dit uiteindelijke inerte, niet-cytotoxische materiaal is bevestigd dat het veilig is voor gebruik in celkweek. Het vertoont geen negatieve effecten op de celgroei of -functie, waardoor uw overgang van 2D naar 3D celkweek eenvoudiger wordt.

3D PETG-steigers zijn ook stijf en degraderen niet, waardoor ze zeer gebruiksvriendelijk zijn voor langdurige celkweek.

Cytotoxiciteit (A) LDH-afgifte (n=3) genoteerd aan de hand van de optische dichtheid bij 490 nm (B) Relatieve fluorescentie-intensiteit van de alamarblauwtest (n=3). L929-cellijn bij een dichtheid van 1 x 104 cellen werden gekweekt met controlemedia, dag 1 geconditioneerde media of dag 7 geconditioneerde media gedurende 24 uur bij 37 °C. Figuur 13. toont (A) LDH afgifte (n = 3) voor elke behandeling voorwaarde zoals genoteerd door optische dichtheid bij 490 nm (B) Relatieve fluorescentie-intensiteit van almarBlue assay (n = 3) voor elke behandeling voorwaarde. Statistische significantie bepaald door Friedmans test; * p < 0,05.

Celproliferatie

Ons PETG-materiaal bemiddelt celdeling terwijl het celverlies tot een minimum wordt beperkt, wat resulteert in een aanzienlijke uitbreiding van culturen in korte tijd. Dit is vooral nuttig voor wie cellen in de exponentiële groeifase wil bestuderen of celdelingsgebeurtenissen in real-time wil onderzoeken.

L929 cellen hieronder vertoonden een duidelijk toegenomen vermogen om langgerekte focale adhesiepunten te vormen op 3D PETG steigers, in vergelijking met een standaard 2D kweek. De focale adhesie aan de verschillende oppervlakken van de steiger is belangrijk voor de initiatie van verschillende signalen, waardoor de celproliferatie en -differentiatie verder gestimuleerd worden (Lee et al, 2004).

(Links) Relatieve fluorescentie-intensiteit van alamarblauwtest (n=3) op tijdstippen; dag 1 en dag
7. Statistische significantie bepaald door gepaarde t-test; * p < 0,05, ** p < 0,01. (Rechts) Langgerekte focale adhesiepunten, wat wijst op een gezonde fibroblastenmorfologie in 3D-kweek.

Sferoïdevorming

Bij gebruik van hoge concentraties voor celzaaiing en langdurige kweek (meer dan 7 dagen) bevorderen 3D PETG-steigers de vorming van sferoïde culturen. Sferoïde kweeksystemen bieden een vergelijkbare fysisch-chemische omgeving in vivo door cel-naar-cel en cel-naar-matrix interacties te vergemakkelijken om de beperkingen van traditionele 2D culturen te overwinnen.

Het 3D PETG-steigersysteem heeft onderling verbonden poriën door de hele structuur en is ontworpen om gemakkelijk sferoïde culturen te kweken en te oogsten. Door gebruik te maken van de opening in het midden van de steiger kunnen gebruikers sferoïde culturen opzuigen en oogsten door met minimale kracht op en neer te pipetteren. Deze nieuwe methode voor het kweken en oogsten van sferoïden stelt gebruikers in staat om betrouwbare 3D-sferoïdemodellen te maken, zonder dat er meerdere stappen nodig zijn en zonder menselijke fouten bij het hanteren van de sferoïden.

 

SEM-afbeeldingen van huidsferoïden gekweekt op 3D PETG-steiger. Fibroblasten en keratinocyten werden 7 dagen gekweekt, na het zaaien bij een concentratie van 100K op dag 1. Sferoïden konden gemakkelijk van de steigers worden geoogst door opzuigen met een pipet en vertoonden minder schade in vergelijking met methoden om van hydrogelsystemen te oogsten.

Organoïde Vorming

Naast de vorming van sferoïden kunnen de 3D-steigers, wanneer ze gebruikt worden in combinatie met de juiste groeifactoren, gebruikt worden om vroege embryonale lichamen en vervolgens organoïden te genereren. Dankzij hun robuuste structuur en sterkte kunnen scaffolds worden gebruikt voor langdurige kweek van organoïden.

Figuur - Vroege embryonale lichaamsstructuren (afbeelding linksboven) kunnen uit de steigerstructuur worden gepipetteerd en verder worden gekweekt om grotere, complexe organoïde structuren (afbeelding rechtsboven) te vormen in platen met een lage aanhechting. De celstructuren kunnen worden gekleurd en gevisualiseerd met microscopie tijdens en na de kweek (afbeelding rechtsonder).

Product Details