Experimenteel protocol voor Western Blotting

 

Eiwitscheiding door gelelektroforese

Voordat een Western blot wordt gemaakt, moeten de eiwitten in een monster worden gescheiden op basis van hun grootte. Meestal wordt dit gedaan met SDS-PAGE (Sodium Dodecyl-Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis), waarbij de concentratie polyacrylamide samen met het buffersysteem de mobiliteit van de eiwitten door de gel beïnvloedt, afhankelijk van hun molecuulgewicht. De gel in SDS-PAGE heeft twee verschillende lagen, die de “stapelende” gel (bovenste laag) en de “scheidende” of “oplossende” gel (onderste laag) worden genoemd.

Zoals weergegeven in de onderstaande tabel, moet de concentratie van de oplossende gel overeenkomen met de grootte van je doeleiwit.

Eiwitgrootte (kDa)	Polyacrylamideconcentratie
≥500	5%
25-200	8%
15-100	10%
10-70	12.5%
12-45	15%
4-40	20%

SDS-PAGE gels kunnen worden gekocht of gemakkelijk zelf worden gemaakt. Een veelgebruikt recept voor het maken van een SDS-PAGE gel is als volgt. Als je een kant-en-klare gel gebruikt, ga dan naar de volgende sectie.

Reagentia	6% Stapelgel	10% Scheidingsgel
ddH2O	2 mL	3 mL
1 M Tris-HCl	400 uL pH 6.7	2.1 mL pH 8.9
30% Acrylamide/Bis- Acrylamide	600 uL	2.8 mL
10% SDS	36 uL	80 uL
10% APS (Ammoniumpersulfaat)	24 uL	50 uL
TEMED (TetraMethylEthyleneDiamine)	4 uL	6 uL

1. Zet de gelcastingset in elkaar volgens de instructies van de fabrikant. Dit omvat het plaatsen van de glasplaten in het frame en ze op hun plaats vastzetten.
2. Plaats het frame in de standaard. Plaats de kam op de juiste plaats.
3. Markeer het glas met een viltstift ~ 1 cm onder de kam. Dit geeft de hoeveelheid scheidingsgel aan die nodig is.
4. Verwijder de kam. Voeg met een pipet een kleine hoeveelheid water toe aan de gelkamer om te controleren of er geen lekken zijn. Verwijder het water met een KimWipe.
5. Meng alle ingrediënten van de scheidingsgel en voeg als laatste TEMED toe.
6. Pipetteer de scheidingsgel in de kamer, tot aan je marker.
7. Om luchtbellen te verwijderen, pipetteer je voorzichtig een kleine hoeveelheid isopropylalcohol (IPS) op de bovenkant van de gel. Laat de gel 30 minuten opstijven.
8. Verwijder de IPA door voorzichtig een KimWipe in de kamer te steken.
9. Meng alle ingrediënten van de stapelgel en voeg als laatste TEMED toe.
10. Pipetteer de stapelgel in de kamer, tot aan de bovenkant van de glasplaat.
11. Plaats de kam. Laat de gel nog 30 minuten uitharden.

 

Monstervoorbereiding

Eiwitten worden meestal geëxtraheerd uit cellen of weefsels met behulp van verschillende extractiebuffers die detergenten, zouten en proteaseremmers bevatten om de integriteit en stabiliteit van eiwitten te behouden.

De hoeveelheid eiwit in het monster wordt geschat met de volgende methoden:

1. Directe methode gebaseerd op absorptie bij 280nm door UV-spectroscopie.
2. Bradford-eiwitbepaling (Bradford Assay Calculator)
3. BCA-eiwitkwantificatietest (Amplite® Colorimetric of Amplite® Fluorimetric of Portelite™ Fluorimetric Assay kits).

Om eiwitten te denatureren en eventuele niet-covalente interacties te verstoren, wordt een reductiemiddel zoals β-mercaptoethanol of dithiothreitol (DTT) toegevoegd aan de monsterbuffer. Daarnaast helpt het verwarmen van de monsters bij ongeveer 95°C gedurende 5 minuten of bij 70°C gedurende 10 minuten om de eiwitten volledig te denatureren. Er wordt een kleurstof aan de eiwitmonsters toegevoegd om hun dichtheid te verhogen, kleur te geven voor visualisatie en de migratie van de monsters tijdens elektroforese te volgen. De kleurstof bevat meestal een traceerkleurstof (bijv. broomfenolblauw of xyleencyanol) en een dichtheidsmiddel (bijv. glycerol) om de monsters in de wells te laten zinken.

Gelelektroforese

Benodigde apparatuur :

• Elektroforesekamer en voedingen
• Micropipet

Benodigde reagentia :

• SDS-PAGE gel
• 1X Lopende buffer (Recept voor 10X Lopende buffer)
• Eiwitmonsters
• Eiwitladder (PageTell™ Prestained 10-250 kDa Ladder of ProLite™ 5-245 kD Eiwitladder)

 

1. Plaats de gelcassette in de elektrodenkamer. Plaats de elektrodenkamer in de elektroforesetank.
2. Verwijder de kam van de gel.
3. Voeg ~200 ml 1x lopende buffer toe aan de binnenste elektrodekamer.
4. Vul de buitenste kamer van de tank tot aan de markering aan de buitenkant van de tank. Zorg ervoor dat de lopende buffer de gel volledig bedekt.
5. Verwarm de monsters in een waterbad bij 95°C gedurende 5 minuten of bij 70°C gedurende 10 minuten.
6. Voeg uw monsters en eiwitladders toe aan de geïdentificeerde wells. Het volume hangt af van het monster, maar ligt over het algemeen tussen 5 - 15 uL per well. Het volume in elke lane moet gelijk gemaakt worden door ddH20 of lysisbuffer te gebruiken.
7. Sluit de elektroforesetank aan op de voeding, rood (+) op rood, zwart (-) op zwart.
8. Laat je gel op het gewenste voltage en gedurende de gewenste tijd draaien. Over het algemeen zijn deze parameters 100 - 150 V gedurende 40 tot 60 minuten.

Het op de gel afgescheiden eiwit kan worden gekleurd met ProLite™ Orange Protein Gel Stain om het totale eiwit op de gel te visualiseren.

Elektro-overdracht

Vervolgens worden de afgescheiden eiwitten op de gel overgebracht op een membraan door middel van een proces dat elektrotransfer wordt genoemd (ook elektroblotten genoemd).

Benodigde apparatuur :

• Transferapparaat
• Spons of schuim, op dezelfde maat gesneden als de gel
• 6 filtreerpapiertjes, op dezelfde maat gesneden als de gel
• Assemblageschaal of blottingcassette

Benodigde reagentia :

• IJs
• Methanol
• PVDF (polyvinylideenfluoride) of nitrocellulosemembraan, gesneden op dezelfde afmetingen als de gel
• 1X Transferbuffer (Recept voor 20X Transferbuffer)

 

1. Maak de spons, het filterpapier en het membraan nat met methanol.
2. Haal de gel voorzichtig uit de gelcassette.
3. Maak voorzichtig een elektrotransfer sandwich door deze in de volgende volgorde te stapelen:

   • (a) Montage ladebodem

   • (b) Drukspons

   • (c) Filterpapier

   • (d) Gel

   • (e) PVDF-membraan

   • (f) Filterpapier

   • (g) Montage lade bovenkant

4. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de sandwich zitten. Knijp extra vloeistof er voorzichtig uit.
5. Plaats de sandwich in de elektroblottingtank, op ijs.
6. Voeg transferbuffer toe aan de elektroblottingtank en bedek de sandwich volledig.
7. Sluit de elektroblottingtank aan op je voeding, rood (+) op rood, zwart (-) op zwart.
8. Laat het elektroblotten systeem gedurende de gewenste tijd draaien, die varieert tussen 45 - 90 minuten.

 

Blokkeren

Een blokkeerstap voorkomt dat antilichamen niet-specifiek aan het membraan binden. Blokkeren verwijdert potentiële achtergrondruis van het membraan, wat de analyse van eiwitten vereenvoudigt. Veel gebruikte blokkers zijn 2-5% BSA of vetvrije melk in gebufferde zoutoplossing (TBS of PBS).

Tabel 1. Vergelijking van blokkeerbuffers voor western blotting.

Blokkeerbuffer	Voordelen	Overwegingen
Magere melk	Goedkoop Bevat meerdere soorten eiwitten	Bevat biotine en fosfoproteïnen, die kunnen interfereren met streptavidine-biotinedetectiestrategieën en detectie van gefosforyleerde doeleiwitten. Vanwege het aantal eiwitten in melk kan melk sommige antigenen maskeren en de detectielimiet van de western blot verlagen.
Gezuiverde eiwitten	Blokkeerbuffers met enkel eiwit bieden minder kans op kruisreactie met assaycomponenten dan serum- of melkoplossingen. Ideaal wanneer blokkers, zoals vetvrije melk, de binding tussen antigeen en antilichaam blokkeren.	Duurder dan traditionele vetvrije melkformules.
Rundsserumalbumine (BSA)	Goed alternatief voor melk Kan worden gebruikt in biotine-streptavidine-systemen of bij sonderen op fosfoproteïnen	Er zijn verschillende BSA-kwaliteiten in de handel die van invloed kunnen zijn op de signaal-ruisverhouding. BSA is over het algemeen een zwakkere blicker, wat kan resulteren in meer niet-specifieke antilichaambinding, maar de detectiegevoeligheid voor laag-abundante eiwitten kan verhogen.

 

Primaire en secundaire antilichaam incubatie

Het eiwit van interesse in een Western blot kan worden gedetecteerd met behulp van een gelabeld primair antilichaam of een ongelabeld primair antilichaam + gelabeld secundair antilichaam.

1. Voeg het primaire antilichaam in 5% BSA (runderserumalbumine) toe aan het membraan.
2. Incubeer het membraan overnacht bij 4°C op een schudapparaat of gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
3. Als je een secundair antilichaam gebruikt, was het membraan dan drie keer met TBST. Incubeer het membraan met het secundaire antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
4. Was het membraan driemaal met TBST.

Opsporing

Bij Western blotting worden detectiemethoden gebruikt om de aanwezigheid van specifieke eiwitten die van de gel naar het membraan zijn overgebracht te visualiseren en kwantificeren. Er kunnen verschillende detectiemethoden worden gebruikt, afhankelijk van de specifieke vereisten van het experiment en het type label dat aanwezig is in uw detectieantilichaam.

Hier volgen enkele veelgebruikte detectiemethoden bij Western blotting:

Chemiluminescentie

Chemiluminescente substraten zoals Amplite® West ECL HRP Substraten genereren licht na een enzymatische reactie met mierikswortelperoxidase (HRP) of alkalische fosfatase (AP), die zijn geconjugeerd aan secundaire antilichamen. Het is een gevoelige methode en geeft een langdurig signaal.

Fluorescentie

Fluorescent gelabelde secundaire antilichamen binden direct aan primaire antilichamen, of primaire antilichamen worden gedetecteerd met behulp van fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen. Deze benadering maakt multiplexing, hoge gevoeligheid en compatibiliteit met verschillende beeldvormingssystemen mogelijk.

De selectiegids voor antilichamen en eiwitlabels kan nuttig zijn bij het plannen van Western blotting en andere immunoassays door informatie te bieden over het kiezen van de meest geschikte antilichamen voor specifieke experimentele behoeften.

Colorimetrische detectie

Enzymatische substraten produceren een gekleurd reactieproduct na reactie met HRP of AP geconjugeerd aan secundaire antilichamen die kunnen worden gebruikt voor het visualiseren van eiwitten in western blot.

Analyse

Bij Western blotanalyse worden heldere blotafbeeldingen in beeld gebracht met gespecialiseerde apparatuur. De bandintensiteit kan worden gekwantificeerd met beeldanalysesoftware, waarbij vaak wordt genormaliseerd naar interne controles voor nauwkeurige vergelijkingen. Statistische tests beoordelen verschillen tussen de geanalyseerde monsters, wat helpt bij het trekken van zinvolle conclusies.

Verken onze digitale catalogus over Western Blotting Assays, zorgvuldig samengesteld om een divers scala aan producten te presenteren, gecategoriseerd voor eenvoudige navigatie en ontdek oplossingen op maat van uw behoeften.