Imunohistoquímica (IHC) Protocolo geral

I. Material necessário
Reagentes
- Um anticorpo primário , marcado ou não, contra a molécula alvo
- Kit de revelação
- Cromogénio

Amortecedores
- Xileno
- Banhos alcoólicos a 70%, 80% e 95%
- Peróxido de hidrogénio (H2O2)
- Tris EDTA, Tris HCl
- Intermédio-20

Material
- Pipetas e Pipet-aid

- Banho de água
II. Duração da experimentação
- 10 mn de bloqueio da peroxidase
- 30 mn de recuperação antigénica
- 1 h de incubação do anticorpo primário
- 10 mn de incubação do cromogénio
- 2 h de etapas de enxaguamento e banhos
- TOTAL : 4 horas


III. Protocolo
- Desparafinar a secção em 3 mudanças de xileno, 5 minutos cada.
- Lavar a secção com álcool benzílico a 96%, 80% e 70% durante 5 minutos cada.
- Enxaguar com água destilada.
- Bloquear a peroxidase endógena incubando o tecido em peróxido de hidrogénio a 3% (H2O2) durante 10 minutos.
- Lavar com água destilada durante 5 minutos.
- Lavar em tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 7,6, suplementado com 0,2% de Tween-20 (tampão A) durante 5 minutos.
- Para produtos concentrados: Incubar a secção com anticorpo primário diluído em tampão A na diluição 1:100 - 200 durante 1 hora na câmara húmida fechada.
Para produtos RTU: Incubar a secção com anticorpo primário (pronto a utilizar) durante 1 hora numa câmara húmida fechada.
- Lavar duas vezes durante 5 minutos com tampão A.
- Aplicar o anticorpo secundário (o protocolo depende do fornecedor) e proceder ao protocolo imunohistoquímico padrão (HRP - Peróxido - DAB).
- Lavar duas vezes durante 5 minutos com tampão A.
- Aplicar o cromogénio (DAB), 10 minutos.
- Lavar em água durante 10 minutos.
- Corar com hematoxilina durante 5 minutos.
- Lavar em água durante 10 minutos.
- Desidratar a secção em 2 mudanças de álcool benzílico a 96% durante 5 minutos cada.
- Lavar a secção em 2 mudanças de xileno durante 2 minutos cada.
- Montar a lâmina para observação.