NeoProof DNA polimerase
Descrição
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Componentes e armazenamento de produtos
- Fornecido com um Tampão de Reação 10× e uma Solução Estabilizadora 5×
- Armazenamento recomendado a -20 °C num congelador a temperatura constante
- Estabilidade até ao prazo de validade se armazenado conforme especificado
- Definição da unidade: incorporação de 10 nmoles de dNTPs em 30 minutos a 72 °C
Protocolo PCR
- Protocolo padrão fornecido como orientação geral para a amplificação por PCR
- Orientações para a preparação da reação, incluindo a ordem dos componentes e a montagem em gelo
- Parâmetros de ciclo para desnaturação, recozimento e extensão
- Eletroforese em gel para análise de produtos PCR
Considerações sobre a conceção da PCR
- Conceção de primers de PCR com comprimento adequado (15-30 bases)
- Recomendações para sequências de primers para melhorar o rendimento da PCR e evitar a degradação
- Directrizes para o conteúdo GC do iniciador e para evitar a estrutura secundária interna
- Recomendações para evitar a formação de dímeros de iniciadores e o recozimento não específico dos iniciadores
- Importância de temperaturas de fusão (Tm) semelhantes para ambos os primers
Modelo de ADN
- Quantidades recomendadas de material de partida com base na qualidade e complexidade
- Orientações para a utilização de modelos de ADN genómico e de modelos de reação de síntese de cADN
- Atenção para não exceder 10% do volume final da reação de PCR para modelos de cDNA
Concentração de enzimas
- Concentração enzimática recomendada de 1,25 U (0,5 μL) numa reação de 50 μL
- Volumes de enzima mais elevados (até 2,5 U) para amplificar modelos abundantes (>50 ng de gDNA)
- Opções de diluição para maior comodidade durante a montagem da PCR
Ensaios de controlo de qualidade
- Avaliação da pureza através de SDS-PAGE e coloração com Coomassie Blue
- Avaliação da contaminação do ADN genómico através de PCR
- Ensaios com nuclease para verificar a existência de nicking ou corte de ácidos nucleicos
- Ensaio funcional utilizando fragmentos de ADN de diferentes tamanhos a partir de ADN genómico humano