NeoProof DNA polimerase

 Descrição

  • NeoProof DNA polimerase NB-60-0006 : uma enzima recombinante com alta fidelidade e excelente desempenho de PCR.
  • Inclui revisão de exonuclease 3'→5' para maior exatidão.
  • Amplifica eficazmente produtos de PCR mais longos (≤10 kb) e permite a mutagénese dirigida ao local.
  • Recomendado para a clonagem de rotina.
  • Taxa de erro comparável à das polimerases de ADN Pfu e Kod, mas significativamente inferior à das polimerases de ADN Taq.
                     

 

Componentes e armazenamento de produtos

  • Fornecido com um Tampão de Reação 10× e uma Solução Estabilizadora 5×
  • Armazenamento recomendado a -20 °C num congelador a temperatura constante
  • Estabilidade até ao prazo de validade se armazenado conforme especificado
  • Definição da unidade: incorporação de 10 nmoles de dNTPs em 30 minutos a 72 °C

 

Protocolo PCR

  • Protocolo padrão fornecido como orientação geral para a amplificação por PCR
  • Orientações para a preparação da reação, incluindo a ordem dos componentes e a montagem em gelo
  • Parâmetros de ciclo para desnaturação, recozimento e extensão
  • Eletroforese em gel para análise de produtos PCR

 

Considerações sobre a conceção da PCR

  • Conceção de primers de PCR com comprimento adequado (15-30 bases)
  • Recomendações para sequências de primers para melhorar o rendimento da PCR e evitar a degradação
  • Directrizes para o conteúdo GC do iniciador e para evitar a estrutura secundária interna
  • Recomendações para evitar a formação de dímeros de iniciadores e o recozimento não específico dos iniciadores
  • Importância de temperaturas de fusão (Tm) semelhantes para ambos os primers

 

Modelo de ADN 

  • Quantidades recomendadas de material de partida com base na qualidade e complexidade
  • Orientações para a utilização de modelos de ADN genómico e de modelos de reação de síntese de cADN
  • Atenção para não exceder 10% do volume final da reação de PCR para modelos de cDNA

 

Concentração de enzimas

  • Concentração enzimática recomendada de 1,25 U (0,5 μL) numa reação de 50 μL
  • Volumes de enzima mais elevados (até 2,5 U) para amplificar modelos abundantes (>50 ng de gDNA)
  • Opções de diluição para maior comodidade durante a montagem da PCR

Ensaios de controlo de qualidade

  • Avaliação da pureza através de SDS-PAGE e coloração com Coomassie Blue
  • Avaliação da contaminação do ADN genómico através de PCR
  • Ensaios com nuclease para verificar a existência de nicking ou corte de ácidos nucleicos
  • Ensaio funcional utilizando fragmentos de ADN de diferentes tamanhos a partir de ADN genómico humano