Protocolo para citometria de fluxo intracelular

I.Material necessário
Reagentes
- Um anticorpo primário contra a molécula alvo
- Um anticorpo secundário em casos de coloração indirecta com um anticorpo primário não marcado.
- Um isótipo de controlo não relevante com um rótulo semelhante ao do anticorpo primário

Amortecedores
- Um tampão de coloração
- Um Tampão de Permeabilização
- Um tampão de fixação intracelular

Material
- Pipetas e Pipet-aid
- Centrifugador
- Congelador
- Citómetro de fluxo


II. Duração da experimentação
- Estimulação das células (depende do tipo de célula)
- 2 a 3 horas de incubação dos anticorpos
- 30 minutos a 1 hora de leitura de amostras com o citómetro de fluxo (depende do número de amostras, da concentração de células e da capacidade do  citómetro)
- TOTAL : 3 a 4 horas


III.Protocolo
- Preparar as células de acordo com o seu protocolo de adaptação de células
- Corar as células de acordo com as recomendações do protocolo geral para células em suspensão
- Após a primeira lavagem, fixar as células com 100 µl de tampão de fixação e agitar os tubos no vórtex
- Incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente numa sala escura
- Centrifugar durante 5 mn (300 - 400g) a 4°c
- Adicionar 1 ml de tampão de permeabilização
- Centrifugar durante 5 mn (300 - 400g) a 4°c
- Adicionar 20 µl de anticorpo primário diluído a uma concentração óptima (de acordo com o fabricante) de 0,5 a 0,6 µg / 106 células) em tampão de permeabilização e agitar em vórtice
- Incubar os tubos durante 20 minutos à temperatura ambiente
- Adicionar 1 ml de tampão de permeabilização
- Centrifugar durante 5 mn (300 - 400g) a 4°c
- Ressuspender as células em 500 µl de tampão de ensaio ou de tampão de fixação suplementado com 2% de formaldeído
- Ler células num citómetro de fluxo


IV. Motores de pesquisa
- Anticorpos primários 
- Anticorpos secundários