ELISA não revestido

I. Required material

Reagents
- Captura de um  anticorpo primário,  específico da molécula alvo
- Detecção de um segundo  anticorpo primário específico da molécula alvo
- Uma molécula recombinante para utilizar como padrão
- Soluções de detecção: por exemplo, estreptavidina-HRP e TMB

Amortecedores
- Tampão de revestimento: por exemplo, PBS
- Tampão de bloqueio: por exemplo PBS com 5% de BSA
- Tampão de lavagem: por exemplo PBS com 0,05%Tween
- Diluente para amostra e padrão: por exmplo PBS 1%BSA
- Solução de paragem: por exemplo, H2SO4 diluído

Material - Placa de microtitulação de 96 poços
- Tampas/vedantes de placas
- Pipetas graduadas de 5 ml e 10 ml
- Micropipetas de canal único ajustáveis de 20 µl a 1.000 µl com pontas descartáveis
- Micropipeta multicanal ajustável de 50 µl a 300 µl com pontas descartáveis
- Reservatório de micropipetas multicanal
- Copos, frascos e garrafas necessários para a preparação dos reagentes
- Dispositivo de distribuição da solução de lavagem (frasco de lavagem multicanal ou sistema de lavagem automático)
- Leitor de placas de microtítulo com capacidade de leitura a 450 nm



II. Período experimental
- 1 a 2h de rotulagem
- 3h de procedimento
- 30 min de várias lavagens
- 10 minutos de leitura
- TOTAL : 4 a 5 horas


III. Procedimento
Revestimento - Diluir o anticorpo de captura até à concentração adequada (de acordo com o folheto) utilizando o tampão de revestimento (é necessário um volume final de 10 ml por placa)
- Adicionar 100 µl da solução de anticorpo de captura a todos os poços da placa, tapar e incubar durante a noite a 4°C
- Aspirar o conteúdo de cada poço e, em seguida, lavar a placa pelo menos duas vezes, utilizando 400 µl de tampão de lavagem em cada poço.

Nota : Após a lavagem final, assegurar que todo o tampão remanescente é removido através de uma ligeira mancha em papel absorvente

- Adicionar 250 µl de solução de bloqueio a todos os poços da placa, tapar e incubar à temperatura ambiente durante 2 horas
- Aspirar o conteúdo de cada poço e, em seguida, lavar a placa pelo menos duas vezes utilizando 400 µl de tampão de lavagem em cada poço; a placa está agora pronta para efectuar o ensaio
Procedimento de ensaio
- Adicionar 100 µl de diluições preparadas de padrão, amostra e controlo aos poços apropriados, cobrir a placa e incubar à temperatura ambiente durante pelo menos 1 hora
- Aspirar o conteúdo de cada poço e, em seguida, lavar a placa pelo menos duas vezes, utilizando 400 µl de tampão de lavagem em cada poço
- Adicionar 100 µl do anticorpo de detecção diluído (diluído de acordo com o folheto) a cada poço, cobrir a placa e incubar à temperatura ambiente durante pelo menos 1 hora
- Aspirar o conteúdo de cada poço e, em seguida, lavar a placa pelo menos duas vezes, utilizando 400 µl de tampão de lavagem em cada poço
- Adicionar 100 µl da solução de estreptavidina-HRP a todos os alvéolos, cobrir a placa e incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos
- Aspirar o conteúdo de cada poço e, em seguida, lavar a placa pelo menos duas vezes, utilizando 400 µl de tampão de lavagem em cada poço
- Adicionar 100 µl da solução de TMB a todos os alvéolos, tapar a placa e incubar à temperatura ambiente durante um mínimo de 10 minutos
Nota : O tempo de incubação da solução de substrato é geralmente determinado pelo desempenho do leitor ELISA. Muitos leitores ELISA só registam a absorvância até 2,0 O.D. Por conseguinte, o analista deve observar o desenvolvimento da cor em cada um dos micropoços e interromper a reacção do substrato antes de os poços positivos deixarem de estar dentro da gama registável
- Adicionar 100 µl de solução de paragem a todos os poços e, no espaço de 30 minutos, medir as leituras de absorvância a 450 nm (quando disponível com 620 nm como comprimento de onda de referência, 610-650 é aceitável)