Os métodos tradicionais de cultura de células 2D sujeitam as células a um estado arquitetónico não fisiológico. Quando cultivadas em 2D, as células de mamíferos assumem um estado bipolar com um lado basal e um lado apical. Para lidar com esta morfologia não natural, ocorre uma remodelação do citoesqueleto e a subsequente ultraestrutura da célula é muito alterada (Ravi et al., 2015). As células cultivadas em 2D também têm acesso ilimitado a oxigénio, nutrientes e metabolitos - o que não acontece nos respectivos tecidos in vivo. Estas limitações significam, em última análise, que os laboratórios que realizam ensaios com células neste ambiente não natural produzem resultados menos fiáveis in vitro.

A cultura de células 3D cria uma arquitetura 3D para o crescimento celular, oferecendo um ambiente mais próximo e fisiologicamente relevante. O crescimento de células em suportes 3D promove interações precisas entre células e entre células e o ambiente extracelular, com acesso variável a oxigénio, nutrientes e metabolitos. As células de mamíferos que se encontram num ambiente mais representativo, reflexo do seu tecido hospedeiro in vivo, exibem uma expressão genética mais relevante, topologia de splicing e biomarcadores in vitro, o que, por sua vez, oferece uma fiabilidade muito maior em termos de modelação de fármacos e toxicidade no la

 Conceção de andaimes

Estudos recentes demonstram a importância de gradientes discretos de oxigénio no movimento das células através da interface do andaime (Ardakani et al, 2014). As células cultivadas em estruturas de woodpile têm normalmente uma distribuição heterogénea, sendo comum a formação de aglomerados. Ao introduzir um gradiente discreto de oxigénio na interface do nosso andaime 3D PETG, incentivamos a proliferação celular do centro para a periferia. O resultado é um sistema muito mais equilibrado de células no suporte, com padrões de confluência semelhantes aos dos tecidos in vivo.

A Copner Biotech desenvolveu um software de modelação 3D personalizado e uma técnica de impressão 3D da próxima geração para criar estas arquitecturas complexas. O nosso processo de fabrico aditivo demonstra uma elevada consistência de lote para lote, minimizando as variáveis nos seus modelos de células 3D.

 

Trabalho de validação da microestrutura do andaime - (Esquerda) Vista superior do andaime de PETG utilizando um microscópio ótico normal. (Direita) Secção transversal de um andaime de PETG capturada por microscopia eletrónica de varrimento (SEM).

Protocolos de esterilização e sementeira de células

Notas antes de começar

• Antes da utilização, os andaimes devem ser tornados hidrofílicos com uma lavagem com etanol a 70 % durante 15 minutos. Note-se que os andaimes devem ser colocados na orientação correta antes de serem utilizados (ver figura abaixo). Ao lavar com etanol, certifique-se de que pipeta a solução cuidadosamente através dos poros interligados do andaime.
• Adicionar etanol suficiente para cobrir completamente o andaime, remover e lavar 2x com o meio de cultura adequado (2 ml).
• Para evitar a secagem, deixar o andaime na lavagem final com o meio (2 ml) até ser necessário.
• Recomendamos que os andaimes sejam deixados neste meio final durante 4 horas para melhorar a fixação subsequente das células.

Orientação correta do andaime - Orientação correta do andaime - O andaime à esquerda representa a orientação correta para utilização, enquanto os outros andaimes estão ao contrário. Tenha em atenção que o aspeto da base dos andaimes pode variar.

Seeding Cells on Scaffold

• Remover todo o meio de cultura celular do poço antes da sementeira, através de uma pipeta.
• Pipetar lentamente a densidade de células pretendida através de uma solução de 100ul de meio de cultura celular para a parte superior do andaime, tendo o cuidado de assegurar que a solução permeia tanto quanto possível os poros interligados.
• Colocar os andaimes semeados de novo na incubadora durante 3 horas para permitir a fixação das células.
• Após as 3 horas de incubação, encher o poço restante com 1,4 ml de meio completo.
• Mudar o meio de cultura de 2 em 2 dias até ao fim da cultura.
• As células podem ser recuperadas do andaime após um tratamento com tripsina 1X durante 15 minutos.
• Recomendamos a utilização de várias densidades celulares inicialmente para otimizar o protocolo de cultura antes das suas experiências.
• A densidade celular recomendada varia entre 150.000 e 500.000 células por andaime.

Fixação celular

Os suportes 3D PETG da Copner Biotech medeiam eficazmente a fixação de células de mamíferos, utilizando simultaneamente baixas concentrações de sementeira de células. As células utilizadas até à data incluem, mas não se limitam a: fibroblastos L929, queratinócitos, células HeLa, células MCF-7, células A549 e iPSCs.

Imagens de Microscopia Eletrónica de Varrimento (SEM) de células L929 cultivadas no suporte PETG ao 7º dia (50K células semeadas no 1º dia). As células demonstram uma migração bem sucedida do centro para a periferia do suporte, criando um sistema celular equilibrado e confluente no processo.

O nosso sistema operacional de impressão 3D personalizado, associado a uma tecnologia de impressão de alta precisão, permite a criação de regiões específicas do andaime com uma rugosidade de superfície óptima. Estas regiões dão origem às primeiras células ligadas com sucesso a partir do primeiro dia de sementeira e actuam como ponto de partida para a proliferação e migração celular para a periferia. A migração é estimulada por gradientes discretos de oxigénio e nutrientes através da interface do andaime, formados pela heterogeneidade da dimensão e distribuição dos poros.

Viabilidade celular

O nosso material PETG foi alterado de forma a otimizar a rugosidade da superfície e, subsequentemente, melhorar a fixação e a proliferação das células. Este material final inerte e não citotóxico foi confirmado como seguro para utilização em cultura de células, não apresentando efeitos negativos no crescimento ou função das células, facilitando a transição da cultura de células 2D para 3D.

Os suportes 3D PETG também apresentam rigidez e não se degradam, o que os torna muito fáceis de utilizar para a cultura de células a longo prazo.

Citotoxicidade (A) Libertação de LDH (n=3) registada pela densidade ótica a 490 nm (B) Intensidade de fluorescência relativa do ensaio alamarBlue (n=3). A linha de células L929 a uma densidade de 1 x 104 células foi cultivada com meios de controlo, meios condicionados no dia 1 ou meios condicionados no dia 7 durante 24 horas a 37°C. A Figura 13 mostra (A) a libertação de LDH (n=3) para cada condição de tratamento, conforme observado pela densidade ótica a 490 nm (B) a intensidade de fluorescência relativa do ensaio almarBlue (n=3) para cada condição de tratamento. Significância estatística determinada pelo teste de Friedmans; * p < 0,05.

Proliferação celular

O nosso material PETG medeia os eventos de divisão celular, minimizando simultaneamente a perda de células, o que resulta numa expansão significativa das culturas num curto espaço de tempo. Isto é particularmente útil para quem procura estudar células na fase de crescimento exponencial ou investigar eventos de divisão celular em tempo real.

As células L929 abaixo demonstraram uma capacidade acentuadamente maior de formar pontos de adesão focal alongados em suportes PETG 3D, em comparação com a cultura 2D padrão. A adesão focal às várias superfícies do suporte é importante para a iniciação de vários sinais, estimulando ainda mais a proliferação e diferenciação celular (Lee et al, 2004).

(Esquerda) Intensidade de fluorescência relativa do ensaio alamarBlue (n=3) nos pontos temporais; dia 1 e dia
7. Significância estatística determinada pelo teste t emparelhado; * p < 0,05, ** p < 0,01. (Direita) Pontos de adesão focal alongados, indicando uma morfologia de fibroblastos saudáveis em cultura 3D.

Formação de esferóides

Quando se utilizam concentrações elevadas de sementeira de células e se faz a cultura durante um período prolongado (mais de 7 dias), os suportes PETG 3D favorecem a formação de culturas esferóides. Os sistemas de cultura de esferóides proporcionam um ambiente físico-químico semelhante in vivo, facilitando as interações célula-célula e célula-matriz para ultrapassar as limitações das culturas 2D tradicionais.

O sistema de andaime 3D PETG tem poros interligados em toda a estrutura e foi concebido para cultivar e colher culturas de esferóides com facilidade de utilização. Utilizando o orifício central do suporte, os utilizadores podem aspirar e colher culturas de esferóides pipetando para cima e para baixo com o mínimo de força. Este novo método de cultura e colheita de esferóides permite aos utilizadores criar modelos 3D fiáveis de esferóides, sem utilizar várias etapas e sem introduzir erros humanos no manuseamento dos esferóides.

 

Imagens SEM de esferóides dérmicos cultivados no suporte 3D PETG. Os fibroblastos e queratinócitos foram cultivados durante 7 dias, após sementeira a uma concentração de 100K no dia 1. Os esferóides foram facilmente colhidos dos suportes por aspiração com uma pipeta e apresentaram danos reduzidos em comparação com os métodos de colheita dos sistemas de hidrogel.

Formação de organóides

Para além da formação de esferóides, quando utilizados em conjunto com os factores de crescimento adequados, os suportes 3D podem ser utilizados para gerar corpos embrióides iniciais e, subsequentemente, organóides. Os andaimes podem ser utilizados na cultura de organóides a longo prazo, devido à sua estrutura robusta e resistência.

Figura - As primeiras estruturas de corpos embrióides (imagem superior esquerda) podem ser pipetadas da estrutura de suporte e posteriormente cultivadas para formar estruturas organóides maiores e complexas (imagem superior direita) em placas de baixa fixação. As estruturas celulares podem ser coradas e visualizadas por microscopia durante e após a cultura (imagem inferior direita).

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